Как определить номер мтс: Как узнать свой номер МТС: ussd-команда, по смс

Содержание

Как определить скрытый номер МТС?

В некоторых случаях услуга «Антиопределитель номера» оказывается полезной, но зачастую ей пользуются в целях сомнительного развлечения или шантажа. Есть несколько способов, которые позволяют определить скрытый номер абонента «МТС».
Инструкция
  • Первый вариант заключается в обращении в офис компании «МТС» за детализацией счета. В данном документе представляется информация о совершенных действиях, их стоимости, в том числе, и о входящих и исходящих звонках. При этом пропущенные звонки в отчете отображены не будут. Поэтому если вы не берете трубку, когда звонит неизвестный номер, определить его будет невозможно. При звонке с такого номера нажмите кнопку ответа, после чего подождите не менее 3 секунд. Это позволит зарегистрировать входящий звонок, и он будет отображен в детализации. Обращаясь в офис компании «МТС», имейте при себе паспорт, который удостоверит вашу личность, а также подтвердит факт владения абонентским номером, детализацию которого вы запрашиваете.
  • Помимо этого, заказать детализацию счета вы можете, используя официальный сайт компании «МТС». Перейдите на официальный сайт оператора по адресу http://www.mts.ru. Откройте раздел «Помощь и обслуживание» и выберите пункт «Детализация счета». После этого кликните по ссылке «через Интернет-помощник», либо сразу перейдите по адресу: https://ihelper.mts.ru/selfcare/. С помощью веб-интерфейса вы можете управлять различными услугами, в том числе, заказом детализации счета.
  • Третий вариант получения информации заключается в звонке в контактный центр «МТС». Наберите с вашего телефона номер 0890 и нажмите кнопку вызова. После соединения с оператором объясните проблему. Также вы можете отправить факс, используя стандартный бланк «МТС», который доступен по адресу http://static.mts.ru/upload/images/subscribers_blanks/add_cancel_services.doc для заказа детализации абонентского счета. Номер для отправки факса вы можете получить на странице http://www.mts.ru/help/service_abonents/contacts/.
  • Совет добавлен 25 июля 2011 Совет 2: Как посмотреть скрытые номера В том случае, если на ваш мобильный телефон поступают звонки со скрытых номеров, это может означать, что либо у вас не подключен определитель номера, либо другой абонент специально скрывает свой номер. В последней ситуации вы поделать ничего не сможете, а вот с первой справитесь без труда, просто активируйте услугу «Определитель номера», она имеется у всех крупнейших операторов связи.
    Инструкция
  • У пользователей сети «Билайн» в распоряжении имеется целых два номера для подключения услуги. Один из них — это бесплатный номер 067409061, а второй — это номер USSD-запроса *110*061#. Использование любого из этих номеров является бесплатным, плата за подключение тоже не взимается. Кстати, для того чтобы эта услуга работала корректно, записывайте все номера в своей телефонной книге в международном формате (то есть он должен начинаться с +7, а не с 8).
  • В «МТС» тоже есть сервис, позволяющий подключить услугу «Определитель номера», называется он «Интернет-Помощник». Он всегда доступен на главной странице официального сайта оператора (просто кликните на отдельное поле с тем же названием, его легко заметить, оно выделено красным цветом). Но имейте ввиду, что для авторизации в системе самообслуживания вам понадобится личный логин и пароль. Для получения логина ничего делать не нужно, им уже является номер вашего мобильного телефона. А вот для получения пароля вам придется послать USSD-запрос *111*25# либо позвонить на короткий номер 1118. После набора одного из указанных номеров следуйте инструкциям оператора.
  • Не забывайте о том, что пароль вы должны установить самостоятельно, длиной он должен быть от четырех до семи символов (цифр). Использование данной системы самообслуживания является бесплатным, но доступ к ней может быть прекращен на некоторое время в том случае, если вами более трех раз будет введен неверный пароль.
  • Абонентам компании «Мегафон» пользоваться услугой «Определитель номера» легче, чем остальным, поскольку подключения в данном случае она не требует. Услуга начинает действовать автоматически, как только сим-карта будет зарегистрирована в сети. Правда, даже эта услуга не поможет определить скрытый номер, если у звонящего абонента активирована другая услуга — «Антиопределитель номера».
  • Как посмотреть скрытые номера — версия для печати Оцените статью!

    МТС и ГИТИС открывают онлайн-прослушивания для школьников Саратова

    Благотворительный проект МТС «Поколение М» открывает перед саратовскими школьниками возможность попробовать себя в роли абитуриента ГИТИСа, не выезжая за пределы родного города. Компания МТС и крупнейший театральный вуз страны проведут онлайн-прослушивание, по результатам которого самые достойные будут рекомендованы для поступления на актерский факультет ГИТИСа.

    Предварительные прослушивания на актерский факультет ГИТИСа будут проходить в Саратове 26 и 27 апреля с 12:00 до 20:00 в режиме zoom-конференции. К участию приглашаются старшеклассники и выпускники школ, которые хотят поступить в театральный вуз и связать свою жизнь со сценой и кино. Оценивать поступающих будет старший преподаватель кафедры мастерства актера ГИТИСа Екатерина Николаева. Самые талантливые будут рекомендованы для прохождения следующих этапов вступительных испытаний в Москве.

    Чтобы принять участие в онлайн-прослушивании, нужно пройти обязательную регистрацию и подготовить программу выступления. Школьникам нужно будет прочитать стихотворение, басню, отрывок из прозы, исполнить вокальный или танцевальный номер. На выступление отводится 10 минут. Подробную информацию будущие участники получат по электронной почте сразу после регистрации. С правилами приема в 2022 году можно ознакомиться на сайте ГИТИСа.

    26 апреля перед прослушиваниями Екатерина Николаева проведет онлайн-лекцию для будущих абитуриентов. Она расскажет о том, как выбирать репертуар, готовиться к экзаменам и чувствовать себя увереннее; познакомит с мастерами, набирающими курсы в ГИТИС в этом году, и ответит на вопросы начинающих артистов.

    «История Саратовского края неразрывно связана с историей российского театра и кино. Саратовский театр драмы — один из старейших театров России. В Саратове родились Олег Табаков, Евгений Миронов, Владимир Конкин и Борис Бабочкин. В Саратовских театрах жили и работали Олег Янковский, Сергей Сосновский, Сергей Пускепалис, Владимир Краснов и многие другие известные актеры. Благодаря цифровым технологиям МТС саратовские школьники, мечтающие о сцене, получат возможность пройти онлайн-прослушивание в ГИТИС и шанс поступить в крупнейший театральный вуз страны», — рассказал директор МТС в Саратовской области Олег Горбачев.

    О программе «Поколение М»

    Проект объединяет идею развития творческих способностей детей из регионов России и благотворительную механику. На основной онлайн-площадке проекта — pokolenie.mts.ru — дети со всей страны могут проявить таланты, участвуя в конкурсах, мастер-классах и интерактивных упражнениях от российских звезд по разным направлениям. Все активности в группах и на сайте «Поколения М» МТС конвертирует в деньги и переводит на лечение тяжелобольных детей.

    О ГИТИСе

    Российский институт театрального искусства — ГИТИС — крупнейший театральный вуз Европы, недавно отметивший 140-летие. Больше 1 600 студентов из всех регионов России и из-за рубежа обучаются сегодня в ГИТИСе на 8 факультетах: актерском, режиссерском, театроведческом, балетмейстерском, факультете музыкального театра, новых направлений сценических искусств, сценографии и продюсерском.

    Источник: пресс-служба ПАО «МТС»

    МТС проведет онлайн-прослушивания в ГИТИС для школьников Самары

    ОбществоОбразование

    11 апреля 2022 16:35

    Благотворительный проект МТС «Поколение М» приглашает талантливых ребят Самары еще до окончания школы попробовать себя в роли абитуриента ГИТИСа, не выезжая за пределы города

    Компания МТС и крупнейший театральный вуз страны проведут онлайн-прослушивание, по результатам которого самые достойные будут рекомендованы для поступления на актерский факультет ГИТИСа.

    Предварительные прослушивания на актерский факультет ГИТИСа будут проходить в Самаре 26 и 27 апреля с 12.00 до 20.00 в режиме zoom-конференции. К участию приглашаются старшеклассники и выпускники школ, которые хотят поступить в театральный вуз и связать свою жизнь со сценой и кино. Оценивать поступающих будет старший преподаватель кафедры мастерства актера ГИТИСа Екатерина Николаева. Самые талантливые будут рекомендованы для прохождения следующих этапов вступительных испытаний в Москве.

    Чтобы принять участие в онлайн-прослушивании, нужно пройти обязательную регистрацию и подготовить программу выступления. Школьникам нужно будет прочитать стихотворение, басню, отрывок из прозы, исполнить вокальный или танцевальный номер. На выступление отводится 10 минут. Подробную информацию будущие участники получат по электронной почте сразу после регистрации. С правилами приема в 2022 году можно ознакомиться на сайте ГИТИСа.

    26 апреля перед прослушиваниями Екатерина Николаева проведет онлайн-лекцию для будущих абитуриентов. Она расскажет о том, как выбирать репертуар, готовиться к экзаменам и чувствовать себя увереннее; познакомит с мастерами, набирающими курсы в ГИТИС в этом году, и ответит на вопросы начинающих артистов.

    «Самарская область подарила российскому театру и кино множество известных имен. Ольга Остроумова, Николай Симонов, Эльдар Рязанов, Игорь Ясулович, Анна Уколова и множество других известных актеров и деятелей искусства родом из нашего края. Сегодня в регионе много молодых талантливых ребят, которые достойны учиться в крупнейшем театральном вузе страны. Цифровые технологии МТС помогут им приблизить свою мечту. Самарские школьники, не выходя из дома, могут познакомиться с педагогами ГИТИС, пройти онлайн-прослушивание и проверить свои шансы на поступление», — рассказал директор МТС в Самарской области Александр Меламед.

    О программе «Поколение М»

    Проект объединяет идею развития творческих способностей детей из регионов России и благотворительную механику. На основной онлайн-площадке проекта –pokolenie.mts.ru– дети со всей страны могут проявить таланты, участвуя в конкурсах, мастер-классах и интерактивных упражнениях от российских звезд по разным направлениям. Все активности в группах и на сайте «Поколения М» МТС конвертирует в деньги и переводит на лечение тяжелобольных детей.

    О ГИТИСе

    Российский институт театрального искусства – ГИТИС – крупнейший театральный вуз Европы, недавно отметивший 140-летие. Больше 1 600 студентов из всех регионов России и из-за рубежа обучаются сегодня в ГИТИСе на 8 факультетах: актерском, режиссерском, театроведческом, балетмейстерском, факультете музыкального театра, новых направлений сценических искусств, сценографии и продюсерском.

    Изготовление на заказ (MTO) против изготовления на складе (MTS) — Katana

    Каковы преимущества изготовления на складе?

    Как уже говорилось ранее, этот метод может оказаться для вас приемлемым, в зависимости от типа вашего бизнеса.

    Но мы все же рассмотрим преимущества и недостатки, чтобы понять, является ли стратегия «производство на складе» той стратегией, которую вы должны использовать. Три преимущества:

    1. Распространение ресурсов и производство

    Поскольку вы будете производить свои продукты, готовые к требованиям клиентов, вы можете правильно и тщательно организовать свои ресурсы и производство, которые будут выполняться для максимальной эффективности.

    2. Планирование изготовления на склад

    Использование этого метода означает, что вы сможете разработать основной производственный график, чтобы убедиться, что ваш рабочий процесс максимально гладок, насколько это возможно. Это позволяет вам и вашим сотрудникам знать, где им нужно быть и что осталось сделать.

    3. Сократите время ожидания клиентов

    Наконец-то ваши товары будут ждать ваших клиентов — очевидно, если все будет выполнено вовремя. Как только ваши клиенты разместят свой заказ, их продукт может быть отправлен им, что значительно сократит время ожидания клиентов.

    Использование метода производства на складе кажется сбывшейся мечтой для тех, кто ценит организацию и полностью контролирует рабочий процесс своего бизнеса.

    Лучшая защита — это, так сказать, сильное нападение.

    Каковы недостатки изготовления на складе?

    Однако эта тактика также может иметь некоторые недостатки, поскольку по наиболее очевидной причине этот тип производственного процесса в значительной степени зависит от предположения отрасли.

    Давайте рассмотрим три недостатка, которые могут повлиять на вас и ваш бизнес:

    1.Непредсказуемый характер потребительских тенденций

    Вы прогнозируете, анализируя исторические продажи и сезонные всплески, но даже если вы сделали его максимально точным и с правильными предположениями, ваши продукты, к сожалению, не продаются так хорошо, как вы изначально предсказывали.

    Или другая крайность, внезапный взрыв, к которому вы не были готовы. Это просто природа зверя.

    2. Уровни запасов

    Технически вы можете постоянно находиться в состоянии либо слишком большого, либо недостаточного запаса.

    3. Трудность составления точных прогнозов продаж

    Отрасль может быть сложной и зависеть от множества переменных, что уже затрудняет прогнозирование ваших продаж. Тем не менее, одна небольшая ошибка или просчет означает, что вы можете получить слишком мало или избыток запасов, что будет стоить вашему бизнесу.

    У любого рабочего процесса есть свои плюсы и минусы — изготовление на склад или изготовление на заказ.

    Тем не менее, вы должны знать, что если вы решите организовать производство, следуя одной из этих тактик, это не обязательно будет вашим окончательным выбором.Вы можете экспериментировать и переключаться между ними, или для вашего бизнеса может быть даже выгодно полностью переключиться на другой рабочий процесс. Все зависит от потребностей вашего бизнеса.

    Но, в любом случае, вы, вероятно, понимаете, что необходимо сделать много работы, независимо от выбора.

    А когда дело доходит до гвоздей, ключевое значение здесь имеет успешная реализация.

    Но как?

    Что такое планирование производства на складе (MTS)? Объяснение, недостатки и пример

    Существует множество производственных стратегий, которые могут использоваться производственными организациями, стремящимися снизить затраты и максимизировать свою прибыль.В идеальном мире производители могли бы заранее знать, сколько единиц каждого продукта будет продано, и производить только это количество. При правильном управлении они смогут координировать производство так, что им никогда не придется хранить какие-либо запасы материалов или незавершенного производства, и у них никогда не будет отходов. Однако реальность сложнее и непредсказуемее. Именно здесь вступают в действие такие производственные стратегии, как «Производство на складе» (MTS), которые помогают производителям планировать свое производство.

    Что такое изготовление на складе (MTS)?

    Планирование производства на склад (MTS) — это широко используемая производственная стратегия, используемая производственными предприятиями, которая включает производство товаров, соответствующих ожидаемому потребительскому спросу. Эта производственная стратегия — это не то же самое, что производить определенное количество товаров, а затем пытаться продать их постфактум.

    В основе метода «Изготовление на склад» лежит то, что производственный план определяется вашим прогнозом спроса. Это означает, что у вас должен быть точный прогноз спроса для правильной работы МТС.Функция Make to Stock оценит, сколько заказов будет создано для каждого продукта, а затем поставит достаточный запас, чтобы в достаточной степени удовлетворить эти заказы.

     

    Недостатки сборки на склад (МТС)

    Использование производственной стратегии «Изготовить на склад» требовало очень точных прогнозов спроса, чтобы правильно определить количество товаров, которые необходимо произвести. Теоретически этот метод можно рассматривать как наблюдение за тем, как компания может подготовиться к изменяющемуся спросу.

    Если ваши прогнозы не точны, у вас будет слишком много запасов, вы рискуете нехваткой запасов или потеряете доход.Трудно точно предсказать будущее, когда вы смотрите только на прошлые данные о продажах. Однако существует множество стратегий прогнозирования, включающих дополнительные компоненты обследования и анализа, которые могут повысить точность прогнозов.

    Общая эффективность МТС целиком и полностью зависит от ее способности прогнозировать будущий спрос на продукты. Эта ненадежность может быть чрезвычайно дорогостоящей для производственных операций. Хотя это один из самых существенных недостатков, если ваше производство имеет стабильный спрос из года в год, МТС может быть для вас выгодным вариантом.

    Если ваш спрос можно точно и точно оценить, то стратегия МТС может стать выгодным решением для вашего производства. Вы сможете сократить расходы, связанные с запасами, увеличить прибыль и более эффективно использовать свои материалы.

     

    Альтернатива МТС — Изготовление на заказ (MTO)

    Для производителей, у которых нет надежных прогнозов спроса, может быть предпочтительнее использовать производственную стратегию «Изготовление на заказ» (MTO). В этой стратегии производство товаров начинается только при наличии фактического спроса (заказа).Эта стратегия предотвращает хранение слишком большого количества запасов.

    Как всегда, не существует производственной стратегии без недостатков. Изготовление на заказ (MTO) может быть осуществимо и выгодно только для производственных операций, которые имеют относительно короткие сроки производства или объекты, которые не имеют большого количества доступных складских площадей.

    Большинство производителей предпочитают использовать комбинацию обеих стратегий. Они будут использовать «Изготовить на склад» для товаров, на которые есть стабильный спрос, и «Изготовить на заказ» для товаров, на которые такого спроса нет.

     

    Пример планирования производства на склад (MTS)

    В следующем примере показаны шаги, которые должен предпринять производитель игрушек, чтобы использовать MTS на своем производственном предприятии.

    1. Создать прогноз . Первым шагом в использовании функции «Создать на склад» является оценка спроса на продукцию, которую необходимо произвести. Существует множество стратегий, которые можно использовать для создания точного прогноза спроса. В этом примере производитель может обнаружить, что в среднем за последний квартал года он продает игрушек на 40% больше.
    2. Производить товары — После того, как прогноз создан, у производителей есть целевое количество товаров для производства. Существует множество этапов планирования и составления графиков, связанных с производством предметов. Плановикам и составителям графиков необходимо будет обеспечить наличие достаточного количества материалов и ресурсов для удовлетворения дополнительного спроса.
    3. Hold In Inventory — Следующим шагом является хранение готовой продукции на складе в ожидании поступления заказов от клиентов.Поскольку это один из самых дорогостоящих шагов, производителям желательно свести к минимуму время хранения товаров.
    4. Получение заказов клиентов — При использовании стратегии «Производить на склад» у вас будут товары на складе, когда поступят заказы ваших клиентов. Если ваш прогноз был точным, у вас должно быть ровно столько товаров на складе, а не больше или меньше.
    5. Доставка покупателю — Последний шаг — отгрузка продукции покупателю. Поскольку ваше производственное предприятие использовало производственную стратегию «Изготовить на склад», вы сможете своевременно доставлять товары своим клиентам.

    Программное обеспечение, которое может помочь в планировании изготовления на склад (MTS), — это программное обеспечение PlanetTogether Advanced Planning and Scheduling (APS). PlanetTogether APS оптимизирует ваш производственный график, чтобы снизить затраты, увеличить прибыль и устранить отходы.

    Это программное обеспечение предоставляет функции одновременного планирования и составления графиков, чтобы вы могли быть уверены, что у вас есть все необходимые материалы и достаточно ресурсов для своевременного производства ваших товаров. Прогнозы также могут быть созданы и включены в ваш производственный график, чтобы вы могли производить товары до того, как заказы клиентов будут введены в вашу систему ERP.

     

    Программное обеспечение Advanced Planning and Scheduling (APS)

    Программное обеспечение

    Advanced Planning and Scheduling Software стало обязательным для современных производственных операций, поскольку потребительский спрос на увеличение ассортимента продукции, быструю доставку и снижение цен становится преобладающим. Эти системы помогают планировщикам экономить время, обеспечивая большую гибкость при обновлении постоянно меняющихся приоритетов, производственных графиков и планов запасов. Системы APS можно быстро интегрировать с программным обеспечением ERP/MRP, чтобы заполнить пробелы, где этим системам не хватает гибкости, точности и эффективности планирования и планирования.

    С PlanetTogether APS вы можете:

    • Создание оптимизированных графиков, обеспечивающих баланс между эффективностью производства и эффективностью доставки
    • Максимально увеличить пропускную способность узких мест для увеличения дохода
    • Синхронизация предложения со спросом для сокращения запасов
    • Обеспечьте доступность ресурсов в масштабах всей компании
    • Включить принятие решений на основе данных сценария

    Внедрение программного обеспечения Advanced Planning and Scheduling (APS) выведет ваши производственные операции на новый уровень эффективности производства за счет использования оперативных данных, которые уже имеются в вашей ERP-системе.APS — это шаг в правильном направлении повышения эффективности и бережливого производства. Попробуйте бесплатную пробную или демо-версию!

    Видео о бережливом производстве

    Ресурсы APS

    Множественный анализ MTS как альтернативный метод определения доли выживаемости облученных клеток рака толстой кишки HT-29

    . апрель-июнь 2016 г.; 6(2):112-6.

    Принадлежности Расширять

    Принадлежности

    • 1 Исследовательский центр стволовых клеток, Медицинский факультет, Университет медицинских наук Голестан, Горган, Иран; Кафедра медицинской физики и клинической биохимии, Медицинский факультет, Университет медицинских наук Голестан, Горган, Иран.
    • 2 Кафедра медицинской физики, Медицинский факультет, Исфаханский университет медицинских наук, Исфахан, Иран.
    • 3 Факультет биотехнологии, Сельскохозяйственный колледж, Исфаханский технологический университет, Исфахан, Иран.
    • 4 Отделение клеточных наук Исследовательский центр медицинских наук, Медицинский факультет, Исфаханский университет медицинских наук, Исфахан, Иран.
    Бесплатная статья ЧВК

    Элемент в буфере обмена

    Захра Араб-Бафрани и др. J Med Signals Sens. апрель-июнь 2016 г.

    Бесплатная статья ЧВК Показать детали Показать варианты

    Показать варианты

    Формат АннотацияPubMedPMID

    .апрель-июнь 2016 г.; 6(2):112-6.

    Принадлежности

    • 1 Исследовательский центр стволовых клеток, Медицинский факультет, Университет медицинских наук Голестан, Горган, Иран; Кафедра медицинской физики и клинической биохимии, Медицинский факультет, Университет медицинских наук Голестан, Горган, Иран.
    • 2 Кафедра медицинской физики, Медицинский факультет, Исфаханский университет медицинских наук, Исфахан, Иран.
    • 3 Факультет биотехнологии, Сельскохозяйственный колледж, Исфаханский технологический университет, Исфахан, Иран.
    • 4 Отделение клеточных наук Исследовательский центр медицинских наук, Медицинский факультет, Исфаханский университет медицинских наук, Исфахан, Иран.

    Элемент в буфере обмена

    Полнотекстовые ссылки Параметры отображения цитирования

    Показать варианты

    Формат АннотацияPubMedPMID

    Абстрактный

    Введен множественный колориметрический анализ для оценки пролиферации и определения доли выживаемости (SF) облученных клеток.Оценка SF на основе информации о кривой роста клеток является основным преимуществом этого анализа. В этом исследовании оценивалась полезность множественного анализа MTS для оценки SF облученных клеток рака толстой кишки HT-29, которые были высеяны до облучения. SF клеток рака толстой кишки HT-29 при облучении фотоном 9 МВ оценивали с использованием множественного анализа MTS и анализа колоний. Наконец, была оценена корреляция между двумя анализами. Результаты показали, что нет существенных различий между SF, полученными двумя анализами при разных дозах облучения (P > 0.05), а кривые выживаемости имеют довольно схожие тенденции. В заключение, множественный MTS-анализ может быть надежным методом определения SF облученных клеток рака толстой кишки, которые высевались до облучения.

    Ключевые слова: раковые клетки толстой кишки; анализ колоний; множественный анализ MTS; покрытие перед облучением.

    Цифры

    Рисунок 1

    Схема сечения ячейки…

    Рисунок 1

    Схематическое сечение фантома для облучения клеток

    фигура 1

    Схематическое сечение фантома для облучения клеток

    Рисунок 2

    Кривая роста клеток…

    Рисунок 2

    Кривая роста клеток, основанная на множественном анализе MTS и задержке в клетке…

    фигура 2

    Кривая роста клеток, основанная на множественном анализе MTS и задержке роста клеток облученных клеток (штриховая линия: а [2 Гр], b [4 Гр], c [6 Гр], d [8 Гр]) по сравнению с контролем клетки (сплошная линия: 0 Гр)

    Рисунок 3

    (a) Кривая выживания, полученная из…

    Рисунок 3

    (а) Кривая выживаемости, полученная при выполнении колонологического и множественного MTS-анализа.(б)…

    Рисунок 3

    (а) Кривая выживаемости, полученная при выполнении колонологического и множественного MTS-анализа. (b) Корреляция обоих упомянутых методов

    Похожие статьи

    • Усиление лучевой терапии с помощью электропорации в клетках рака толстой кишки человека HT-29.

      Ядоллапур А., Резаи З., Баяти В., Тахмасеби Биргани М.Дж., Негад Дехбаши Ф. Ядоллапур А. и соавт. Азиатский Pac J Рак Prev. 2018 26 мая; 19 (5): 1259-1262. doi: 10.22034/APJCP.2018.19.5.1259. Азиатский Pac J Рак Prev. 2018. PMID: 29801410 Бесплатная статья ЧВК.

    • Куркумин традиционной китайской медицины повышает чувствительность рака толстой кишки человека к радиации, изменяя экспрессию генов, связанных с репарацией ДНК.

      Yang G, Qiu J, Wang D, Tao Y, Song Y, Wang H, Tang J, Wang X, Sun YU, Yang Z, Hoffman RM. Ян Г и др. Противораковый Рез. 2018 Январь; 38 (1): 131-136. doi: 10.21873/anticanres.12200. Противораковый Рез. 2018. PMID: 29277765

    • Наночастицы золота в сочетании с энергией мегавольтного излучения усиливали радиосенсибилизацию и апоптоз в клетках рака толстой кишки НТ-29.

      Сабери А., Шахбази-Гахруи Д., Аббасиан М., Фешараки М., Бахарлуи А., Араб-Бафрани З. Сабери А. и др. Int J Radiat Biol. 2017 март; 93(3):315-323. doi: 10.1080/09553002.2017.1242816. Epub 2016 2 ноября. Int J Radiat Biol. 2017. PMID: 276

    • Напряжение кислорода в двух линиях опухолевых клеток человека, выращенных и облученных в виде многоклеточных сфероидов.

      Schwachöfer JH, Acker H, Crooijmans RP, Van Gasteren JJ, Holtermann G, Hoogenhout J, Jerusalem CR, Kal HB.Швахофер Дж. Х. и соавт. Противораковый Рез. 1991 г., январь-февраль; 11(1):273-9. Противораковый Рез. 1991. PMID: 2018361

    • Тетрандин: мощный блокатор функции контрольной точки G2 в опухолевых клетках и ее механизм.

      Sun XC, Cheng HY, Deng YX, Shao RG, Ma J. Сан XC и др. Биомед Окружающая среда Sci. 2007 Декабрь; 20 (6): 495-501. Биомед Окружающая среда Sci. 2007. PMID: 18348409

    Цитируется

    9 статьи
    • Понижение уровня DUSP9 способствует прогрессированию опухоли и способствует неблагоприятному прогнозу при колоректальном раке человека.

      Цю Зи, Лян Н, Хуан Ц, Сунь Т, Сюэ Х, Се Т, Ван Х, Ван Ц. Цю Зи и др. Фронт Онкол. 2020 23 сен;10:547011. doi: 10.3389/fonc.2020.547011. Электронная коллекция 2020. Фронт Онкол. 2020. PMID: 33072575 Бесплатная статья ЧВК.

    • Быстрая доставка наночастиц золота в клетки рака толстой кишки HT-29 с помощью электропорации: исследование in vitro.

      З АБ, Д СГ, М А.З.А.Б. и др. J Biomed Phys Eng. 2020 1 апреля; 10 (2): 161-166. дои: 10.31661/jbpe.v0i0.579. Электронная коллекция 2020 апр. J Biomed Phys Eng. 2020. PMID: 32337183 Бесплатная статья ЧВК.

    • Эффективное совместное культивирование клеток фибробластов человека (HFC) и стволовых клеток жировой ткани (ADS) на нановолокне желатин/PLCL.

      Ранджбар-Мохаммади М., Мусави Э., Мостахдем Хашеми М., Аббасиан М., Асади Дж., Эсмаили Э., Фешараки М., Асади П., Араб-Бафрани З.Ранджбар-Мохаммади М. и соавт. ИЭТ Нанобиотехнологии. 2020 фев; 14 (1): 73-77. doi: 10.1049/iet-nbt.2019.0278. ИЭТ Нанобиотехнологии. 2020. PMID: 31935681 Бесплатная статья ЧВК.

    • Однокомпонентная комбинаторная библиотека, полученная из лигандов-мишеней для обнаружения и лечения плоскоклеточного рака полости рта.

      Ян Ф., Сяо В., Лю И., Лю Р., Крамер Р., Ли Х., Аджена Ю., Бэр К.М., Роджалин Т., Чжан Х., Лам К.С.Ян Ф и др. Онкотаргет. 2019 10 сентября; 10 (52): 5468-5479. doi: 10.18632/oncotarget.27189. Электронная коллекция 2019 10 сентября. Онкотаргет. 2019. PMID: 31534631 Бесплатная статья ЧВК.

    • Оценка радиосенсибилизирующей активности бромелаина для лучевой терапии клеток рака молочной железы 4T1.

      Раиси Ф., Шахбази-Гахруи Д., Раиси Э., Хейдариан Э. Раиси Ф. и др.J Med Signals Sens. 2019, январь-март; 9(1):68-74. doi: 10.4103/jmss.JMSS_25_18. J Med Signals Sens. 2019. PMID: 30967992 Бесплатная статья ЧВК.

    Рекомендации

      1. Ван К.В., Лу Х.Л., Песня CC, Лю Х., Сюй К.Г. Радиочувствительность клеток рака толстой кишки человека усиливается иммунолипосомным доцетакселом.Мир J Гастроэнтерол. 2005; 11:4003–7. — ЧВК — пабмед
      1. Зальц Л.Б., Минский Б.В. Адъювантная терапия рака толстой и прямой кишки.Surg Clin North Am. 2002; 82: 1035–58. — пабмед
      1. Chen WS, Lee YJ, Yu YC, Hsaio CH, Yen JH, Yu SH и др. Повышение радиочувствительности p53-мутантных клеток колоректального рака человека флавоноидом физетином. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010;77:1527–35.- пабмед
      1. Прайс П., Макмиллан Т.Дж. Использование анализа тетразолия для измерения реакции опухолевых клеток человека на ионизирующее излучение. Рак Рез. 1990; 50:1392–1396. — пабмед
      1. Кори А.Х., Оуэн Т.К., Барлтроп Дж.А., Кори Дж.Г.Использование водорастворимого тетразолия/формазана для анализа роста клеток в культуре. Раковая коммуна. 1991; 3: 207–212. — пабмед

    Показать все 20 ссылок

    Парковка в Petco Park — Что нужно знать перед поездкой | Инсайдерский парк Petco

    Возможно, вы удивитесь, узнав, что в нескольких минутах ходьбы (менее 20 минут) от стадиона «Падрес» есть почти 30 000 парковочных мест.Если вы подготовитесь с небольшим знанием местности, припарковаться рядом с парком Петко для игры в Падрес на самом деле довольно безболезненно.

    Petco Park Советы по парковке

    Вам нужно парковочное место рядом с Petco Park для вашего предстоящего бейсбольного матча или мероприятия в центре города? Сделайте свою поездку в Petco Park беззаботной, заранее забронировав гарантированное место на парковке. Начните здесь

    Зарезервируйте места заранее

    Вы можете забронировать место для парковки на странице парковки Petco Park SpotHero.Просто выберите свое мероприятие, и вы увидите доступные места и карту вариантов парковки со скидкой до 50% на некоторые тарифы. Если вы предпочитаете приобрести билет на вторичном рынке, посмотрите, что владельцы абонементов SD Padres продают на VividSeats.

    Есть ли бесплатные парковочные места?

    В Petco Park нет бесплатной парковки.

    Сколько стоит парковка в Petco Park?

    Парковочные места на бейсбольном стадионе стоят недешево: от 10 до 40 долларов в зависимости от того, насколько близко вы находитесь к стадиону.Парковочные места в центре города доступны всего за 5 долларов, но ожидайте, что вам придется пройти значительное расстояние от игры. Самые дешевые места — самые дальние от стадиона.

    Гаражи поблизости

    6th & K Parkade — 1000 мест, расположенное 298 на 6th Ave между K & L St. Буквально через дорогу от главных ворот. $15
    525 B Street — 600 мест. Park-It-On-Market — 500 мест, Market и 6th.
    Manchester Grand Hyatt — 700 мест на 1 Market Place (перейти через пешеходный мост)

    Расположение парковок и подробная информация

    Лучшие парковки открываются за 1,5–2 часа до первой подачи в игровой день.Премиум-локации будут открываться не позднее, чем за 3 часа до начала игры. Все места открыты до 2:00 ночи.

    Padres Game Parking Tips

    1. Возьми троллейбус — это ответ № 1 не просто так. Если вы живете за городом, вы можете бесплатно доехать до стадиона Qualcomm или Старого города и сесть на троллейбус или убер/лифт до ближайшей троллейбусной станции.
    2. Паркуйтесь ДАЛЬШЕ от стадиона. Погода в SD прекрасная, люди дружелюбные, баров и ресторанов много.Припаркуйтесь в Маленькой Италии или даже до парка Бальбоа и просто прогуляйтесь. Внедрение Lime Bike дает еще одну интересную возможность оправдать парковку немного дальше.
    3. Лучший шанс найти дешевую парковку рядом с парком Petco — это прибыть около 5:00 и занять место на улице, так как рабочий день подходит к концу и сотрудники в центре города отправляются домой. Подайте счетчик на несколько четвертей до 18:00 и наслаждайтесь бесплатной парковкой после этого.
    4. Одни из лучших парковочных мест находятся через дорогу от стадиона на стоянке у конференц-центра (10-15 долларов).
    5. Оставьте машину дома и возьмите такси или автобус
    6. Получите преимущество, прибыв немного раньше. У всех нас один и тот же план, поэтому всего 5 или 10 минут до пика могут иметь огромное значение.
    7. Парковочные билеты в центре города стоят 30 долларов 42,50 долларов. Обратите особое внимание на вывешенные знаки и окрашенные бордюры
    8. Спланируйте свой выход и припаркуйтесь соответствующим образом. Вы можете сэкономить час, припарковавшись на правильной улице в правильном направлении.
    9. Парковаться легко, если вы воспользуетесь услугами LYFT или Uber (новые подписчики получают бесплатный кредит!)
    10. Двигайтесь в центр города! Свободные квартиры найти легче, чем свободные парковочные места.
    11. Оплатите парковку заранее (см. ниже)

    Заранее купите Padres Parking

    Прежде чем отправиться в центр города, взгляните на SpotHero. Вы можете приобрести место заранее, и ваша парковка будет гарантирована на 100%, даже если в противном случае место будет заполнено.Просто предъявите свое подтверждение на лоте, никаких дополнительных платежей и комиссий. Просмотрите наличие мест и цены в режиме реального времени во многих местах в нескольких минутах ходьбы от парка Petco, нажав ниже.

    Парковка для инвалидов в парке Petco

    San Diego Padres Игры предназначены для всех, независимо от того, выигрывают они или проигрывают. Парковка в Gaslamp всегда является тяжелым испытанием, но были приняты некоторые меры, чтобы облегчить жизнь гостям с ограниченными возможностями, которые обычно имеют доступ к парковочным местам для инвалидов.Цены на парковочные сооружения различаются в зависимости от их удобства для Petco Park. Но каждый из них предоставляет определенное количество мест для инвалидов для гостей с ограниченными возможностями. Кроме того, есть две зоны для высадки гостей с ограниченными физическими возможностями: вход со стороны 6-й авеню и К-стрит, а также с другой стороны парка, 10-й авеню и Парк-бульвар. Падрес также публикует полное руководство для гостей с ограниченными возможностями на своем веб-сайте.

    Парковочные счетчики и правила парковки в центре Сан-Диего

    Уличная парковка доступна для тех, кому посчастливится/наберется терпения ее найти.Парковка у счетчиков бесплатна по воскресеньям и в нерабочее время. Раньше после 18:00 можно было бесплатно припарковаться в центре города на метровых площадях, что было удобно для фанатов Падрес, направляющихся после работы на игру в центре города. Теперь в зоне Газового фонаря возле парка Петко использование парковочных счетчиков будет осуществляться с 10:00 до 20:00. Включенные улицы находятся между Бродвеем и Харбор Драйв, от 1-й авеню до 7-й авеню, к западу от парка Петко. Если вы паркуетесь на восток, вам все ясно. Вы можете припарковаться бесплатно после 18:00.Настоящий ключ к уличной парковке в центре Сан-Диего — обязательно знать правила нарисованного бордюра.


    Petco Park Insider — это путеводитель, который поможет болельщикам насладиться событиями и бейсбольными играми в центре Сан-Диего. Присоединяйтесь к обсуждению в Твиттере @PetcoParkSD или свяжитесь с нами по поводу информации, размещенной на этом сайте. По вопросам о билетах и ​​впечатлениях от стадиона звоните по телефону 619-795-5000 или свяжитесь с Padres.

    Вам также могут понравиться:

    Простой анализ клеточного цикла с высоким содержанием выявляет частые несоответствия между числом клеток и анализами АТФ и пролиферации MTS

    Abstract

    Чтобы эффективно охарактеризовать как антипролиферативную эффективность, так и механизм действия малых молекул, нацеленных на клеточный цикл, мы разработали высокопроизводительный анализ на основе изображений для определения количества клеток и распределения фаз клеточного цикла.Используя это, мы профилировали эффекты экспериментальных и одобренных противораковых агентов с рядом механизмов действия на набор клеточных линий, сравнивая прямой подсчет клеток и , два формата анализа жизнеспособности/пролиферации клеток на основе метаболизма, АТФ-зависимую биолюминесценцию, Восстановление MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) и флуоресцентный анализ ДНК-связывающего красителя во всей лунке. Мы показываем, что, в зависимости от механизмов действия соединений, прокси-анализы на основе метаболизма часто склонны к 1) значительной недооценке активности и эффективности соединения и 2) немонотонным кривым доза-реакция из-за зависящего от концентрации фенотипического «переключения». .В частности, активность и эффективность агентов, направленных на синтез ДНК, таких как гемцитабин и этопозид, могут быть сильно недооценены анализами восстановления АТФ и MTS. В том же анализе, основанном на изображениях, мы показали, что вызванное лекарствами увеличение содержания АТФ было связано с увеличением размера клеток и пропорциональным увеличением содержания митохондрий и респираторного потока, сопутствующим остановке клеточного цикла. Таким образом, различия в механизме действия соединений и реакциях, специфичных для клеточных линий, могут давать значительно вводящие в заблуждение результаты при использовании анализов восстановления АТФ или тетразолия в качестве косвенного показателя количества клеток при скрининге соединений на антипролиферативную активность или профилировании панелей клеточных линий на чувствительность к лекарственным средствам.

    Образец цитирования: Chan GKY, Kleinheinz TL, Peterson D, Moffat JG (2013) Простой анализ клеточного цикла с высоким содержанием выявляет частые несоответствия между числом клеток и анализами пролиферации АТФ и MTS. ПЛОС ОДИН 8(5): е63583. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583

    Редактор: Rafael Moreno-Sanchez, Национальный институт кардиологии, Мексика

    Получено: 15 мая 2012 г.; Принято: 8 апреля 2013 г.; Опубликовано: 17 мая 2013 г.

    Авторское право: © 2013 Chan et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

    Финансирование: Авторы не имеют поддержки или финансирования для отчета.

    Конкурирующие интересы: GKYC, TLK и JGM владеют акциями Roche. Все авторы являются сотрудниками компании Genentech, входящей в группу Roche. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые нужно декларировать.Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

    Введение

    Анализы пролиферации на планшетах являются основным инструментом в разработке онкологических препаратов для оценки эффективности соединений и чувствительности различных клеточных линий к конкретным агентам. Исторически сложилось так, что прямые измерения числа клеток не были практичными при использовании высокопроизводительных анализов на основе титрационных микропланшетов, особенно при использовании 384- и 1536-луночных планшетов высокой плотности.Поэтому наиболее распространенный подход к оценке количества клеток, пролиферации клеток и жизнеспособности клеток, в зависимости от точки зрения исследователя, заключается в измерении количества на лунку какого-либо аспекта клеточного метаболизма или биомассы в качестве косвенного показателя количества жизнеспособных клеток. . Тщательный обзор этих и других непрямых методов определения количества клеток был недавно представлен Quent et al [1]. В этом исследовании мы сосредоточимся на трех наиболее распространенных методах; определение АТФ в клеточных лизатах с помощью биолюминесценции, генерируемой люциферином/люциферазой (например,грамм. CellTiter-Glo (Promega), ATPlite (Perkin Elmer)) [2]–[4], восстановление солей тетразолия, таких как MTS и MTT, до формазана клеточными дегидрогеназами (митохондриальными и другими) [3], [5]–[ 7] и определение общего количества нуклеиновой кислоты на лунку флуоресцентными цианиновыми красителями, связывающими двухцепочечную ДНК (например, CyQuant (Invitrogen), picoGreen (Invitrogen)) [8]. Как правило, эти тесты не определяют абсолютные массовые количества или молярные концентрации аналитов, но дают сигналы, которые, как было продемонстрировано, имеют широкий динамический диапазон и линейный отклик в пределах соответствующих концентраций аналита.

    При использовании этих анализов эффективность (обычно EC 50 или IC 50 ) и эффективность (процент снижения ответа по сравнению с необработанным контролем, E max ) являются критическими параметрами для интерпретации кривых доза-реакция соединения, например, различий на E max может быть достаточно, чтобы различать цитостатический и цитотоксический механизмы действия (MoA).

    Центральное место в интерпретации этих данных с точки зрения воздействия лечения на «пролиферацию», «количество клеток» или «жизнеспособность» занимает предположение о том, что существует линейная зависимость между количеством клеток и сигналом, т.е.е. количество аналита или активности на клетку остается неизменным. Однако это предположение не всегда оправдано. Например, соединение, которое увеличивает размер клеток без изменения цитоплазматической концентрации АТФ, будет менее эффективным в анализе АТФ, чем его фактическое влияние на количество клеток. Эта возможность подтверждается имеющимися в литературе данными о сложной регуляции клеточного энергетического метаболизма и функции митохондрий во время апоптоза и в ответ на лечение различными противораковыми препаратами [9]–[14].

    В отличие от этих прокси-анализов, микроскопия и анализы с высоким содержанием с использованием ДНК-связывающих красителей для визуализации ядер клеток позволяют напрямую определять количество клеток, избегая этих потенциальных искажающих факторов. Кроме того, визуализация и количественная оценка ядерной интенсивности и морфологии является богатым источником информации о соединении MoA, особенно для лечения, которое влияет на клеточный цикл и выживание клеток. Понимание механизмов действия имеет решающее значение для оптимизации кандидатов в лекарства, поскольку нецелевая активность, включая, но не ограничиваясь этим, цитотоксичность, часто является мешающим фактором в анализах.Кроме того, при профилировании чувствительности панели клеточных линий к интересующему специфическому агенту фенотипические ответы различных клеточных линий как на целевую, так и на нецелевую активность могут быть как информативными, так и сбивающими с толку.

    Здесь мы сообщаем о разработке и внедрении простого анализа на основе изображений без отмывки для одновременного определения абсолютного числа клеток и распределения по фазам клеточного цикла прикрепленных или суспензионных клеток в 384-луночных планшетах. Используя этот анализ, мы можем легко дифференцировать МоА различных агентов на одной и той же клеточной линии, одного и того же агента на разных клеточных линиях и, что особенно важно, продемонстрировать, что для одного препарата нередко бывают разные МоА в разных концентрациях.

    Используя данные прямого подсчета клеток, мы демонстрируем, что MoA препарата и изменчивость клеточной линии могут способствовать значительной недооценке эффективности и/или максимальной эффективности при использовании анализов снижения АТФ или MTS по сравнению с фактическим количеством клеток, присутствующих в лунке. В то время как аналогичные наблюдения были сделаны ранее с конкретными соединениями, сравнивающими различные форматы непрямого анализа, мы систематически исследовали панель нацеливания на клеточный цикл и химиотерапевтических агентов, представляющих несколько механизмов действия.Мы также искали механистическое объяснение этих наблюдений. Этот анализ показывает, что расхождения между форматами анализов связаны с изменениями объема цитоплазмы и митохондриальной массы, вызванными препаратами с различными МоА, нацеленными на клеточный цикл. Таким образом, понимание MoA препарата или, по крайней мере, осведомленность о потенциальном влиянии различных MoA на результаты анализа имеет решающее значение для выбора соответствующей стратегии анализа и обеспечения точного анализа и интерпретации данных.

    Материалы и методы

    Культура клеток

    Клеточные линии были получены от ATCC (Манассас, Вирджиния) и поддерживались в полной питательной среде: RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma; St.Louis, Миссури) и 1X GlutaMAX™ (Life Technologies; Карлсбад, Калифорния).

    Составная обработка

    Ингибиторы были получены собственными силами и от коммерческих поставщиков: афидиколин, цисплатин, доксорубицин, этопозид, нокодазол и винбластин (EMD Chemicals; Philadelphia, PA), гемцитабин (Tocris, Ellisvile, MO), паклитаксел (Life Technologies), 5-фторурацил. (Сигма). Все остальные соединения были синтезированы в Genentech. Клетки высевали в 384-луночные планшеты при соответствующей плотности для каждой клеточной линии в 45 мкл среды и оставляли при комнатной температуре (КТ) на 30 минут перед инкубацией при 37 °°С в течение ночи для прикрепления.Предварительная инкубация при комнатной температуре сводит к минимуму температурные градиенты, пока клетки оседают на дно планшета для анализа, что обеспечивает более равномерное распределение клеток внутри лунки [15]. Соединения серийно разводили в ДМСО и дополнительно разбавляли до 16-кратной конечной концентрации в среде перед тем, как к клеткам добавляли 3 мкл соединения. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,25%. Клетки инкубировали с соединениями при 37 ° С в течение 1-3 сут без дальнейшей смены сред и повторного добавления соединений.

    Анализы на «распространение»

    Анализ CellTiter-Glo (Promega): Измерения проводились в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, планшеты удаляли из инкубатора и оставляли для уравновешивания при комнатной температуре в течение 20 минут, после чего прямо в лунки добавляли равные объемы реагента CellTiter-Glo. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере и измеряли люминесценцию с помощью ридера Envision (PerkinElmer). Показания люминесценции нормализовали и выражали как относительный процент от усредненного по планшету контроля ДМСО.

    Анализ CellTiter-AQueous MTS (Promega): Измерения проводились в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, 10 мкл реагента MTS добавляли непосредственно в лунки и планшеты с клетками инкубировали при 37 °°С в течение минимум 1 часа. Поглощение измеряли при 490 нм на ридере SpectraMax Plus384 (Molecular Devices; Sunnyvale, CA). Фоновое поглощение сначала вычитали, используя набор лунок, содержащих только среду, затем нормализовали и выражали в виде относительного процента усредненного по чашкам контроля ДМСО.

    Прямой анализ CyQUANT: Измерения проводились в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies).Реагент для обнаружения 2X готовили путем добавления поставляемого прямого красителя нуклеиновых кислот и прямого фонового супрессора I в среду для культивирования клеток. Затем прямо в лунки добавляли равные объемы этого детектирующего реагента 2X и планшеты с клетками инкубировали при 37 °°C в течение 1 часа. Флуоресценцию измеряли при возбуждении 508 нм и испускании 527 нм на ридере Infinite® M1000 PRO (Tecan; Маннедорф, Швейцария). Фоновую флуоресценцию сначала вычитали, используя набор лунок, содержащих только среду, затем нормализовали и выражали в виде относительного процента усредненного по планшету контроля ДМСО.

    Анализ клеточного цикла FACS

    клетки НТ29 высевали в чашки диаметром 10 см и оставляли для прикрепления на ночь при 37 °°С. Среду отсасывали и заменяли средой, содержащей соответствующую концентрацию соединения. Клетки дополнительно инкубировали с соединениями в течение 24 часов при 37 °°C перед сбором, дважды промывали и ресуспендировали в 2 мл PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Клетки фиксировали холодным 70% этанолом не менее 1 часа при 4°С.После 2 промывок PBS клетки ресуспендировали в 2 мл окрашивающего раствора йодистого пропидия (PI)/РНКазы (Cell Signaling Technology; Danvers, MA) и инкубировали не менее 3 часов при 4°C. Клетки анализировали с помощью BD Проточный цитометр FACSCalibur™ (BD Bioscience; Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Сигнал флуоресценции PI на пике FL2-A в зависимости от количества использовали для определения распределения клеточного цикла.

    Анализ клеточного цикла с высоким содержанием

    После обработки соединением клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали ядра в один этап путем добавления равного объема фосфатно-солевого буфера, содержащего 2-кратную конечную концентрацию 0.25% параформальдегида (Electron Microscopy Sciences; Hatfield, PA), 0,075% сапонина (Sigma) и 2 мкг/мл Hoechst 33342 (Life Technologies) непосредственно в лунки. Планшеты с клетками инкубировали в темноте при комнатной температуре на шейкере в течение 30 минут перед визуализацией на системе скрининга высокого содержания Opera ® (PerkinElmer Inc). Изображения были получены с использованием 10-кратного водного иммерсионного объектива и неконфокального УФ-канала. Для каждой лунки регистрировали шесть полей изображения, что соответствовало примерно 40% площади лунки.

    Обнаружение митохондрий

    Живые клетки инкубировали с 100 нМ MitoTracker Deep Red FM (Life Technologies) с 200 нМ TMRE (этиловый эфир тетраметилродамина, Life Technologies) или без него при 37 ° C в течение 30 минут. Затем клетки можно визуализировать вживую в этот момент или, в нашем случае, зафиксировать и окрасить, как описано выше, чтобы обеспечить одновременный анализ клеточного цикла. Конфокальные изображения были получены с использованием инструмента Opera одновременно с изображениями флуоресценции ДНК, как описано выше, с использованием лазера возбуждения 635 нм и дихроичного излучения 690/50 для MitoTracker Deep Red и возбуждения 532 и излучения 585/50 для TMRE.

    Измерение скорости потребления кислорода

    Клетки высевали по 20000 клеток на лунку в 96-луночные XF микропланшеты для клеточных культур (Seahorse Bioscience), предварительно обработанные поли-D-лизином, и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2. Для анализа скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного подкисления среду для выращивания заменяли предварительно нагретой средой, не содержащей бикарбонатов и сыворотки, и планшет загружали в анализатор внеклеточного потока XF96 (Seahorse Bioscience).Измерения исходного уровня OCR определяли для клеточных линий HT29, предварительно обработанных противораковыми агентами в течение 24 часов. Были проведены измерения исходного уровня OCR и ECAR, и клетки были последовательно обработаны 1 мкМ олигомицина (Cell Signaling), а затем 1 мкМ FCCP (Abcam). Количество клеток, использованное для нормализации, определяли путем фиксации планшета после анализа 4% параформальдегидом, окрашивания Hoechst, визуализации 4 квадрантов на лунку на Molecular Devices ImageXpress HCS и подсчета среднего числа ядер на квадрант.

    Анализ данных

    изображения были проанализированы с помощью пользовательского сценария, написанного в Acapella® (PerkinElmer Inc.). Сегментация изображения для идентификации ядер и расчет интегральной интенсивности пикселей для каждого объекта в эмиссионном канале Hoechst выполнялись с помощью оптимального модуля «обнаружение ядер». Затем количество клеток (ядер) нормализовали и выражали как процент от усредненного по чашкам контроля ДМСО. Для анализа распределения клеточного цикла интегральную интенсивность флуоресценции Hoechst сначала преобразовывали в log 2 .Для каждого эксперимента сначала анализировали log 2 гистограмм интенсивности из нескольких контрольных лунок с ДМСО для определения значения интенсивности, соответствующего центру субпопуляции 2N. Затем это значение применяли в качестве входного параметра для определения диапазона поиска точного пика ДНК 2N для каждой лунки и для нормализации интенсивности ДНК к этому значению, чтобы максимум пика 2N соответствовал 1, а центр 4N ДНК пик соответствовал 2. Затем отдельные клетки классифицировали в соответствии с содержанием ДНК; sub-G1 (log2 нормализованная интенсивность ДНК <0.75), 2Н (0,75–1,25), С (1,25–1,75), 4Н ​​(1,75–2,5) и >4Н (>2,5). Затем выводили процент клеток в каждой фазе на лунку. Для митохондриальных признаков краситель MitoTracker использовался для определения цитоплазматической области вокруг каждого обнаруженного ядра с использованием модуля «обнаружение цитоплазмы» Acapella, а площадь, средняя интенсивность и интегральная интенсивность определялись для каждой клетки. Среднее значение интегрированных интенсивностей MitoTracker и TMRE для всего отображаемого поля в лунке рассчитывали, затем нормализовали и выражали как кратное изменение относительно усредненного по планшету контроля ДМСО.

    Кривые доза-реакция для подсчета клеток, анализов АТФ и MTS анализировали с использованием модуля Condeseo программы Genedata Screener (GeneData AG). Стратегия надежной подгонки (двухвзвешенная по Тьюки) использовалась для подгонки данных к 4-параметрической логистической подгонке со следующими ограничениями: 20 50 <1.

    Результаты

    Разработка и проверка клеточного цикла и анализа числа клеток

    Для изучения эффективности и механизмов действия соединений с предсказанными антипролиферативными эффектами и эффектами, опосредованными клеточным циклом, мы оптимизировали процедуру окрашивания и визуализации фиксированных клеток с высокой пропускной способностью.Количественное определение мертвых/отделившихся, а также жизнеспособных клеток желательно при анализе профилей потенциально индуцирующих апоптоз или цитотоксических агентов. С этой целью мы разработали протокол без каких-либо промывок или смены среды. Классификация фаз клеточного цикла была достигнута с помощью гистограммы ДНК, поэтому поддержание линейной зависимости между содержанием ДНК и интегрированной интенсивностью ДНК было критически важным. Это было достигнуто с помощью проницаемости фиксированных клеток мягким детергентом для облегчения однородного окрашивания Hoechst.

    Чтобы убедиться, что количественное определение содержания ДНК было линейным, клетки HT29 обрабатывали лекарственными средствами, вызывающими специфические фенотипы остановки клеточного цикла, как показано на рисунке 1.Ингибитор киназы MEK, PD901, вызывал остановку клеточного цикла в контрольной точке G1/S (содержание ДНК 2N) за счет усиления p27 и подавления циклина D1 [16], [17], антимитотический препарат паклитаксел вызывал остановку митоза (4N ДНК), в то время как ингибитор киназы Aurora VX-680, который, как известно, вызывает эндоредупликацию [18], давал популяцию клеток с содержанием ДНК 8N. На рисунке 1А показано, что для гистограмм интегральной интенсивности ДНК, преобразованной по логарифму 2, наблюдалось ожидаемое двукратное (на одну единицу) увеличение интенсивности пиков между центрами пиков 2N, 4N и 8N.«Золотым стандартом» определения содержания ДНК является проточная цитометрия; сравнительные данные, показанные на рисунке 1B, показывают, что основное различие заключается в уширении пиков 2N и 4N с интенсивностью, полученной из изображения, и, соответственно, в отсутствии отчетливой промежуточной совокупности S-фазы, однако, если к обоим наборам применяются одни и те же правила биннинга. данных частоты субпопуляций в условиях контроля и медикаментозного лечения сопоставимы.

    Рисунок 1. Анализ клеточного цикла с высоким содержанием.Клетки

    HT29, обработанные указанными препаратами в течение 48 часов в 384-луночном планшете, фиксировали и окрашивали Hoechst 33452, визуализировали и оценивали общую интенсивность окрашивания отдельных ядер, как описано в разделе «Материалы и методы». А . Гистограммы содержания ДНК для log-2 трансформированных значений интенсивности ДНК, нормализованных к модальному значению ДНК 2N. Указана автоматическая классификация на суб-G1, 2N, S-фазу, 4N и 8N популяции. Б . Гистограммы содержания ДНК, полученные с помощью проточной цитометрии, необработанные данные FL2-A нормализовали и группировали таким же образом, как и данные с высоким содержанием. С . Количественный анализ долей подгрупп гистограмм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g001

    Определение механизмов действия соединений на основе анализа клеточного цикла

    Дозозависимые изменения числа клеток и распределения популяций клеточного цикла измеряли одновременно описанным выше методом. Для первоначальной валидации анализа использовали клетки HT29, обработанные в течение 48 часов. Эта клеточная линия была выбрана потому, что наличие мутации B-Raf(V600E) придает способность индуцировать цитостатическую остановку G1 с помощью ингибиторов киназы пути MAPK, а также потому, что их морфология подходит для анализа изображений (т.е. рост в виде монослоя с отдельными ядрами и цитоплазмой, надежно обнаруженными с помощью автоматической сегментации изображений).

    Был протестирован набор химиотерапевтических агентов и ингибиторов киназ с известной или прогнозируемой активностью в отношении определенных точек клеточного цикла, как показано в таблице 1. На рисунке 2A показаны дозозависимые изменения числа клеток и популяционных фракций для подмножества этих соединений. . Профили субпопуляций клеточного цикла для всех других протестированных соединений представлены на рисунке S1.

    Рисунок 2. Профили клеточного цикла, полученные в результате анализа с высоким содержанием.

    Клетки на тех же изображениях, которые использовались для прямого подсчета клеток, были классифицированы по пяти ячейкам клеточного цикла по интегральной интенсивности ДНК. A. Столбцы с накоплением показывают относительную частоту субпопуляций при указанных концентрациях. Каждый бар представляет собой среднее значение двух лунок. Черные кружки обозначают относительный номер ячейки. B. Гистограммы интегральной интенсивности ДНК, полученные из изображений отдельных лунок, показывающие изменение профиля клеточного цикла от EC 90 (верхние панели) до более высоких доз этопозида, гемцитабина и VX-680.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g002

    Большинство соединений показали изменения профиля клеточного цикла в соответствии с их ожидаемыми MoAs, совпадающими с уменьшением числа клеток. Например, паклитаксел индуцировал сильную остановку митоза (содержание ДНК 4N) в широком диапазоне концентраций. Аналогичные результаты были получены для другого препарата, стабилизирующего микротрубочки, эпотилона В, и для агентов, дестабилизирующих микротрубочки, нокодазола, колцемида и винбластина (рис. S1).

    Однако ряд соединений, примерами которых на рис. 2 являются этопозид, гемцитабин, VX-680 и BI-2536, продемонстрировали дальнейшие изменения в профиле клеточного цикла при более высоких концентрациях, давая двухфазную дозозависимую реакцию. Гистограммы содержания ДНК на рисунке 2B более подробно иллюстрируют переключение с профиля при ~EC 90 на ответ при более высоких концентрациях. При подсчете клеток EC 90 этопозид показывает преобладающую остановку G2, в то время как при 62 мкМ наблюдается значительно большая гетерогенность и более крупная фракция суб-G1.В диапазоне концентраций гемцитабина 10–100 нМ преобладает популяция S-фазы, но при более высоких концентрациях гистограмма показывает сдвиг к ранней остановке в S-фазе. В то время как VX-680 является ингибитором Aurora A и B, фенотипический ответ обычно согласуется с ингибированием Aurora B [18]. Накопление клеток с 8N (и более высокой плоидностью) ДНК, показанное на рисунках 1 и 2, является типичным. Снижение уровня АТФ и MTS на втором этапе совпало с изменением профиля клеточного цикла с преимущественно 8N на более крупные фракции 4N и суб-G1 (рис. 2B).В других случаях, когда имело место изменение доминантного фенотипа при разных концентрациях, напр. цисплатин, стауроспорин и ингибитор cMet/ALK киназы кризотиниб [19] показали переход от 4N ДНК (G2 или M) к значительной популяции суб-G1 (ядерная фрагментация/апоптоз) при более высоких тестируемых концентрациях.

    Сообщалось, что ингибитор PLK1 BI-2536 вызывает остановку прометафазы с последующей митотической катастрофой и апоптозом в клетках HeLa и HCT116 [20]–[22]. В случае HT29 преобладала популяция 4N (прометафаза), но очень небольшая популяция суб-G1 в 48-часовой момент времени.

    Значение этого метода для обнаружения неожиданных нецелевых эффектов соединений было продемонстрировано наблюдением, что предполагаемый ингибитор киназы cMet ARQ-197 (тивантиниб) [23] ингибирует пролиферацию клеток и вызывает остановку М-фазы (рис. S1), что не является фенотипом, ожидаемым для ингибирования cMet. Это наблюдение согласуется с недавним сообщением о том, что тивантиниб ингибирует полимеризацию тубулина [24].

    Сравнение форматов анализа

    Таким образом, анализ с высоким содержанием позволил провести прямое сравнение активности и эффективности соединений, определенных путем прямого подсчета клеток , ​​по сравнению с анализами АТФ-зависимой люциферазы/люциферина и MTS-восстановления.Также сравнивали анализ общей флуоресценции ДНК (CyQuant).

    Для сравнения различных форматов анализов повторные планшеты обрабатывали серийными разведениями каждого соединения в течение 48 часов. Были проведены 20-точечные двукратные серийные разведения, чтобы гарантировать, что будет наблюдаться полный диапазон ответов. Затем обрабатывали один повторный планшет для каждого стандартного анализа ATP CellTiter-Glo, колориметрического анализа MTS, CyQuant и анализа высокого содержания, как описано выше. Кривые доза-реакция для числа клеток и сигналов анализа люциферазы, MTS и CyQuant анализировали путем подбора 4-параметрической логистической модели с неограниченными верхней и нижней асимптотами и подходящими критериями приемлемости, как определено в разделе методов.Значения EC 50 (концентрация, дающая 50 % максимального отклика) и E max (максимальное снижение сигнала в процентах, определяемое нижней асимптотой аппроксимирующей кривой) из этих аппроксимирующих кривых приведены в таблице 1.

    Как показано в таблице 1, степень совпадения между числом клеток и результатами прокси-анализа на основе метаболизма значительно различалась между соединениями. В то время как значения EC 50 , полученные из числа клеток, в большинстве случаев были сопоставимы с результатами анализов АТФ и MTS, агенты, нацеленные на синтез ДНК, были поразительным исключением.Кроме того, некоторые виды лечения (например, ингибиторы митотической киназы BI-2536 и VX-680) дали немонотонные кривые доза-ответ с анализами АТФ и MTS, которые не могли быть сопоставлены с действительными кривыми (см. Рисунок 3A), хотя количество клеток доза — кривые отклика были хорошо себя ведут.

    Рисунок 3. Сравнение анализов АТФ и MTS с прямым подсчетом клеток.

    Повторные чашки с клетками HT29 обрабатывали, как указано, в течение 48 часов, а затем анализировали с помощью анализа АТФ или MTS или подсчета клеток с высоким содержанием. A. Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки), анализа АТФ (RLU) (синие треугольники) и анализа MTS (E 490 ) (зеленые квадраты), линии указывают соответствие 4-параметрической логистической модели. Если линия не показана, регрессия не привела к получению кривой, отвечающей критериям приемлемости. B. Нормализованные значения прямого числа клеток (красные кружки) и анализа ДНК (CyQuant) (синие треугольники) номер сотового (синие треугольники) D. Кратность изменения нормализованного отношения сигнала анализа ДНК к количеству клеток.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g003

    Эффективность, или E max , результаты показали большие различия, чем значения EC 50 между форматами анализа для многих видов лечения. Как правило, несмотря на то, что количество клеток уменьшалось примерно на 80% при максимально эффективных концентрациях, снижение сигнала АТФ и MTS было значительно меньшим; например, все агенты, нацеленные на микротрубочки, давали значения E max в диапазоне 45–60% снижения.В крайних случаях афидиколина и гемцитабина снижение сигнала АТФ и MTS было недостаточным для достоверного подбора кривой, несмотря на снижение количества клеток примерно на 80%.

    Кривые доза-реакция для выбранных соединений, которые показали значительные различия между анализами, представлены на рисунках 3А и 3В. Отклонения между числом клеток и сигналами анализа АТФ или MTS (рис. 3C) и общей ДНК (рис. 3D) иллюстрируются кратным изменением нормализованного отношения сигнала к количеству клеток. Кривые для других соединений, перечисленных в таблице 1, представлены на рисунке S2.Гемцитабин, аналог нуклеозида, и этопозид, ингибитор топоизомеразы II, наряду с афидиколином и цисплатином, которые также ингибируют репликацию ДНК, представляют собой класс соединений, которые показали самые поразительные расхождения между анализами. Кривые АТФ и МТС для этопозида были смещены вправо более чем в 10 раз по отношению к количеству клеток, но сходились к аналогичному значению E max при максимальной концентрации. Таким образом, соотношение АТФ и МТС на клетку показало колоколообразную реакцию с максимальным увеличением в 4-5 раз.Гемцитабин индуцировал увеличение АТФ и MTS на клетку аналогичной величины, но в этом случае повышение было постоянным, а кривые АТФ и MTS не снижались и не сходились с числом клеток вплоть до самой высокой испытанной концентрации (25 мкМ).

    Расхождения между различными кривыми доза-реакция для паклитаксела (рис. 3) и других препаратов, воздействующих на микротрубочки (рис. S2), не были такими значительными, как для агентов, воздействующих на ДНК. В то время как кривые EC 50 с для MTS и АТФ не были сдвинуты относительно числа клеток, значения E max были значительно меньше (45% и 55% соответственно), чем 85% снижение абсолютного числа клеток.Это соответствовало 2-кратному увеличению АТФ/клетку и МТС/клетку.

    PD901, который вызывает фенотип остановки G1, давал число клеток и кривые АТФ, которые полностью накладывались друг на друга, однако кривая MTS была значительно более плоской, что соответствовало примерно 2-кратному увеличению соотношения MTS/клетки. Уменьшение абсолютного числа клеток было меньше для этой обработки, чем другие, которые также были цитостатическими. Это согласуется с тем фактом, что PD901 ингибирует клеточное деление при переходе G1/S, поэтому любые клетки в S-, G2- или M-фазе во время воздействия препарата завершат одно удвоение до остановки.

    Эффекты двух ингибиторов митотической киназы, VX-680 и BI-2536, также показаны на рис. 2. Кривые количества клеток показали монотонное снижение, позволяющее надежно определить EC 50 , но кривые доза-реакция АТФ были значительно больше. сложный. VX-680 давал двухступенчатое двухфазное снижение с начальным снижением при концентрации, аналогичной ответу количества клеток, с последующим плато при эффекте ~30% перед вторым снижением. С другой стороны, сигнал MTS не уменьшался до той же концентрации, что и второй шаг кривой АТФ.Ингибитор PLK1 BI-2536 также давал кривые доза-реакция АТФ и MTS, которые значительно отличались от количества клеток и поражали своей сложностью. Оба анализа показали многофазные кривые доза-реакция (рис. 3), где начальное снижение сигнала соответствовало ответу количества клеток, за которым следовал рост, прежде чем снова падать при более высоких концентрациях.

    Данные, полученные с использованием общего сигнала флуоресценции ДНК (CyQuant), также сравнивали с прямым подсчетом клеток. В отличие от двух других прокси-анализов, этот сигнал анализа не должен зависеть от изменений размера клеток или метаболической активности.Присутствие непроницаемого для клеток гасящего реагента позволяет ограничить анализ обнаружением только клеток с интактными плазматическими мембранами. На рисунке 3B показано, что для одного и того же набора соединений было значительно меньше расхождений по количеству клеток, чем в прокси-анализах на основе метаболизма. Однако некоторые обработки, например этопозид, паклитаксел и VX680, по-прежнему вызывали значительные различия в значениях E max между числом клеток и сигналом CyQuant. Эти различия полностью согласуются с изменениями среднего соотношения ДНК/клетки, ожидаемыми для накопления клеток с содержанием ДНК 4N или 8N, нанесенными на график в виде нормализованного отношения на фигуре 3D.

    Аналогичные эффекты наблюдаются в нескольких клеточных линиях

    Мы также хотели определить, могут ли эти изменения распространяться на большее количество клеточных линий. Набор соединений, которые демонстрировали значительные отклонения между форматами анализов, анализировали параллельно в анализах высокого содержания, АТФ и MTS, как описано выше, с использованием еще 5 клеточных линий; A375 (BRafV600E, p53wt), A549 (k-ras G12Sp53 wt), HCT116 (k-Ras G12D, p53 wt, PI3Ka h2047R), DLD1 (K-Ras G13D, p53-mut) и NCI-h2299 (N-Ras Q61K , p53-нуль).

    Кривые доза-реакция для подсчета клеток, анализов АТФ и MTS для гемцитабина, этопозида, VX-680 и BI-2536 показаны на рисунке 4. Результаты подбора кривых (EC 50 и E max ) для этих и других соединений приведены в таблице S1). Результаты для этопозида аналогичны HT29 для всех линий; наиболее существенное различие между анализами АТФ и MTS и прямым подсчетом клеток заключается в недооценке эффективности (т. е. кривые, сдвинутые вправо). DLD-1 отличается большим сдвигом и более значительным подъемом сигнала MTS, чем ATP.Однако во всех случаях сигналы ATP и MTS достигают такого же E max , как и количество клеток. Гемцитабин по-разному влиял на соотношение АТФ/клетка и MTS/клетка в разных клеточных линиях. A549, A375 и HCT116, которые относятся к p53-дикому типу, показали 5-10-кратные сдвиги в EC 50 , при этом кривая E max близка к количеству клеток E max – это соответствует временному повышению АТФ/клетка и МТС/клетка. DLD1 и h2299, которые, как и HT29, являются p53-нулевыми, демонстрируют повышенный уровень АТФ и MTS на клетку во всем диапазоне эффективных концентраций (7 нМ – 25 мкМ) и, таким образом, значительно меньше E max .Другой протестированный ингибитор синтеза ДНК, афидиколин, показал аналогичную разницу в АТФ и MTS E max между клеточными линиями p53-wt и p53-null (таблица S1).

    Рисунок 4. Сравнение анализов АТФ и MTS с прямым подсчетом клеток для нескольких клеточных линий.

    Повторные планшеты с клетками обрабатывали, как указано, в течение 48 часов, затем анализировали с помощью анализа АТФ или MTS или подсчета клеток с высоким содержанием. Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки), анализа АТФ (RLU) (синие треугольники) и анализов MTS (E 490 ) (зеленые квадраты), линии указывают соответствие 4-параметрической логистической модели.Если линия не показана, регрессия не привела к получению кривой, отвечающей критериям приемлемости.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g004

    Ответы клеток на VX-680 согласуются с данными HT29, обсуждавшимися выше. Во всех случаях кривые АТФ и MTS показывают небольшое начальное снижение при тех же концентрациях, что и количество клеток, из-за увеличения сигнала АТФ и MTS на клетку. Профили клеточного цикла показывают такое же двухфазное накопление фракций 8N, а затем 4N при возрастающих концентрациях, как описано выше для HT29 (данные не показаны).Ингибитор PLK1 BI-2536 индуцировал такие же аберрантные кривые АТФ и MTS, как описано выше для HT29, для всех клеточных линий, кроме HCT116 и h2299. Как показано в таблице S1, достоверное соответствие не может быть получено для 4/6 клеточных линий с помощью анализа MTS.

    Одновременное определение митохондриальной массы, числа клеток и распределения клеточного цикла

    Наблюдаемое увеличение количества АТФ на клетку указывает либо на увеличение размера клетки (объем цитоплазмы) при постоянной концентрации АТФ, либо на увеличение концентрации АТФ и метаболической активности, вызванное лекарственными препаратами.Чтобы измерить как метаболическую (генерирующую АТФ) способность, так и размер клеток, мы расширили наш протокол анализа с высоким содержанием, включив в него окрашивание красителем MitoTracker Deep Red, который накапливается в активных митохондриях и сохраняется при фиксации и проницаемости мягкого детергента [25]. , [26]. Таким образом, мы смогли количественно определить митохондриальную массу вместе с содержанием ДНК в расчете на одну клетку.

    Эффекты выбранных соединений проиллюстрированы на рисунке 5. Репрезентативное изображение клеток, окрашенных MitoTracker, из одной из тех же лунок, которые использовались для получения данных, показано на рисунке 5A.На рисунке 5B показано количественное определение митохондриальной массы в зависимости от содержания ДНК. Каждое изображение и график были получены из лунок, обработанных концентрациями, наиболее близкими к номеру клетки EC 90 . В некоторых случаях очевидно поразительное вызванное лекарствами увеличение окрашивания и морфологии MitoTracker на клетку. Увеличение митохондриальной массы может быть связано либо с большей плотностью (например, митохондриальной пролиферацией), либо с увеличением размера клеток при сохранении постоянной плотности. На рисунке 5C показано, что в последнем случае была очевидна четкая корреляция между площадью клеток, определенной с использованием фонового окрашивания MitoTracker, и интегральной интенсивностью MitoTracker.Данные для других испытанных соединений представлены на рисунке S3.

    Рисунок 5. Влияние обработки соединением на массу митохондрий и размер клеток. Клетки

    HT29 обрабатывали указанными препаратами в течение 48 часов. (Афидиколин; 3,1 мкМ, этопозид; 3,9 мкМ, гемцитабин; 24 нМ, паклитаксел; 98 нМ, VX-680; 195, нМ, PD901; 390 нМ). A. Изображения ДНК, окрашенной Hoechst 33452 (красный), и окрашивание MitoTracker в глубокий красный-FM (зеленый) были получены с помощью иммерсионного объектива с 20-кратным увеличением, как описано в разделе «Методы».Все изображения показаны с одинаковым увеличением и масштабированием интенсивности. Масштабная линейка = 50 мкм. B. MitoTracker темно-красные изображения, показывающие идентификацию и сегментацию клеточных границ. C. Графики рассеяния и гистограммы интегрированной интенсивности ДНК, нормализованной по логарифму 2 (ось x, верхние панели гистограммы) и интегральной интенсивности цитоплазматического окрашивания MitoTracker Deep Red FM (ось y, гистограммы справа), полученные из тех же лунок, как показано в части A. D. Варьирование площади клеток и содержания митохондрий (интегрированная интенсивность темно-красного цвета MitoTracker) для одних и тех же клеточных популяций, нормированное как кратное изменение относительно средней площади и интенсивности образцов, обработанных ДМСО.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g005

    Лечение этопозидом и гемцитабином привело к образованию клеток с большими неконденсированными ядрами, профили содержания ДНК соответствовали остановке в контрольной точке повреждения ДНК G2 для первого и во время S -фаза для последнего. Ингибитор Aurora B VX-680 индуцировал крупные многодольчатые ядра, преимущественно с содержанием ДНК 8N. Эти механизмы остановки клеточного цикла также были связаны со значительным увеличением цитоплазматической и общей площади клеток, что соответствовало увеличению содержания митохондрий.Графики зависимости площади клетки от содержания митохондрий для других испытуемых соединений, представленные на рисунке S2, показывают, что другие соединения, которые увеличивали размер клетки; афидиколин, BI-2536, доксорубицин также вызывали пропорциональное увеличение содержания митохондрий. В то время как паклитаксел и другие агенты, нацеленные на микротрубочки, также вызывали сильную остановку митозов, не наблюдалось ни наблюдаемого увеличения средней площади клеток, ни содержания митохондрий. Клетки, задержанные в G1 с помощью PD901, не имели значительных изменений в интенсивности окрашивания MitoTracker по сравнению с контролем ДМСО.

    Ранее было показано, что митохондрии пролиферируют непрерывно и асинхронно на протяжении всего клеточного цикла, чтобы поддерживать постоянную митохондриальную массу на клетку при каждом клеточном делении [27], поэтому ожидается, что клетки в G2 и M-фазе будут иметь большее содержание митохондрий, чем G1 клетки. Данные на рисунке 5B позволили нам оценить, было ли увеличение активности АТФ и MTS на клетку просто связано с увеличением доли более крупных клеток G2/M. Однако, хотя клетки 4N в необработанных образцах показали некоторое увеличение интегрированной интенсивности MitoTracker по сравнению с популяцией 2N, они по-прежнему имели значительно более низкую интегрированную интенсивность, чем индуцированные этопозидом 4N и индуцированные гемцитабином клетки S-фазы.Поэтому накопление митохондриальной массы и АТФ является специфическим ответом на медикаментозное лечение.

    Индуцированное лекарствами увеличение митохондриальной массы коррелирует с изменениями соотношения АТФ:клетки

    Затем мы попытались определить, существует ли количественная связь между увеличением митохондриальной массы и изменениями соотношения АТФ/клетка и MTS/клетка. Прямое сравнение средней интегрированной интенсивности MitoTracker на клетку с сигналом анализа АТФ на клетку для клеток HT29, обработанных этопозидом и гемцитабином, представлено на рисунке 6A.Этот график показывает, что дозозависимое увеличение обоих значений на клетку сильно коррелирует. В случае гемцитабина, как видно из графиков зависимости доза-реакция, оба значения увеличиваются до плато. Этопозид, однако, показывает коррелированное увеличение и последующее снижение обоих значений при повышении концентрации, что отражает двухфазные или колоколообразные кривые доза-реакция и двухфазный механизм действия этого препарата.

    Рисунок 6. Индуцированное лекарственным средством увеличение митохондриальной массы коррелирует с увеличением уровня АТФ на клетку и сигналом анализа MTS.

    A. Корреляция между АТФ/клетка (RLU/количество клеток) и средней интегрированной интенсивностью MitoTracker на клетку для каждой точки кривых доза-реакция. Каждая точка представляет собой среднее значение повторных лунок. Цвета обозначают относительные концентрации в 2-кратных разведениях от самой высокой (красный) до самой низкой (синий). Точки соединяются в порядке концентрации. B, C На верхних панелях показано кратное изменение средней интегральной интенсивности окрашивания MitoTracker на клетку в зависимости от концентрации. На нижних панелях показаны кривые доза-реакция для общей митохондриальной массы (количество клеток, умноженное на среднюю интенсивность MitoTracker для каждой клетки) (фиолетовые), наложенные на данные анализа АТФ (синие). B. клеток HT29, обработанных указанными соединениями. C. Различные клеточные линии, как указано, обработанные гемцитабином.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g006

    На рисунке 6B интенсивность MitoTracker на клетку для клеток HT29, обработанных указанными соединениями, нанесена на верхних панелях. Данные интенсивности MitoTracker были получены из тех же образцов, что и данные подсчета клеток и клеточного цикла на рисунках 3 и 5. Чтобы установить, было ли увеличение массы митохондрий на клетку достаточным для объяснения изменений отношения общего АТФ к количеству клеток , общую массу митохондрий на лунку рассчитывали путем умножения количества клеток на среднюю интенсивность MitoTracker на клетку.Построение этого значения дало кривые доза-реакция для общей митохондриальной массы на лунку, которые точно соответствуют сигналу АТФ на лунку (нижние панели, рисунок 6B).

    Тот же анализ представлен на рис. 6C для пяти других клеточных линий, обработанных гемцитабином. Зависящие от клеточной линии вариации АТФ в зависимости от количества клеток отражают изменения общей митохондриальной массы на лунку.

    Результаты EC 50 и E max для кривых доза-реакция общей митохондриальной массы на лунку, показанных здесь, и для в общей сложности восьми соединений, протестированных против всех шести клеточных линий, включены в таблицу S1 вместе с ячейкой. подсчет, данные анализа АТФ и MTS.Результаты определения общей митохондриальной массы хорошо согласуются с результатами анализа АТФ.

    Изменения митохондриальной активности, вызванные лекарственными препаратами

    На изменения содержания АТФ в клетках может влиять не только размер клеток, но и изменения дыхательной активности. Поэтому мы проверили, коррелирует ли увеличение количества АТФ на клетку с увеличением метаболической активности при лечении, которое вызывало или не вызывало соответствующие изменения в митохондриальном содержании. Клетки HT29, обработанные выбранными соединениями в течение 24 часов, анализировали на скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного подкисления (ECAR), меру гликолитической активности.Затем эти значения были нормализованы по количеству клеток (рис. S4). Повторяющиеся планшеты анализировали на содержание АТФ, количество клеток, размер клеток и массу митохондрий, как описано выше, однако митохондрии также окрашивали красителем TMRE, чувствительным к мембранному потенциалу, чтобы проверить, влияет ли лекарственное лечение на ΔΨ.

    Базовые данные OCR, нормализованные для каждой клетки, нанесены на график относительно содержания АТФ и митохондрий в каждой клетке на рисунках 7A и 7B. Для этопозида, гемцитабина и VX-680 изменения OCR на клетку очень похожи на изменения размера клеток и массы митохондрий, тогда как потенциал митохондриальной мембраны существенно не изменяется (как определено отношением TMRE к интенсивности глубокой красной флуоресценции MitoTracker) (Рисунок 7С).Это согласуется с гипотезой о том, что увеличение количества АТФ на клетку для этих классов соединений связано с увеличением размера клеток и митохондриальной массы, а не с изменениями в митохондриальной функции. Соотношение окислительного и гликолитического метаболизма также не изменилось. Паклитаксел, с другой стороны, индуцировал значительное увеличение количества АТФ на клетку, как описано выше, без какого-либо повышения метаболической активности (как OCR, так и ECAR незначительно снижались в пересчете на клетку). PD901 имел неожиданный эффект значительного подавления OCR, несмотря на отсутствие наблюдаемого влияния на содержание митохондрий или АТФ.

    Рисунок 7. Влияние медикаментозного лечения на функцию митохондрий.

    Базовая скорость потребления кислорода (OCR), определенная для клеток, обработанных указанными соединениями (этопозид, 10 мкМ; гемцитабин 0,1 мкМ; паклитаксел 0,01 мкМ; PD901 1 мкМ, VX-680 0,2 мкМ), нормализовали по количеству клеток. OCR на клетку сравнивают с нормализованным RLU, генерируемым АТФ ( A ), и митохондриальной массой ( B ). Клетки, проанализированные на митохондриальную массу с помощью окрашивания MitoTracker Deep Red, также окрашивали красителем, чувствительным к потенциалу митохондриальной мембраны TMRE, и сравнивали средние интегрированные интенсивности ( C ).Все данные были нормализованы как отношение средних значений, обработанных ДМСО, и представляют собой среднее значение четырех повторных лунок, планки погрешностей показывают стандартное отклонение.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g007

    Временная зависимость изменения формата между анализами

    Время обработки 48 часов было выбрано для вышеуказанных исследований, поскольку оно соответствует примерно 2-3 удвоениям для большинства клеточных линий, таким образом, начальное количество клеток достаточно для получения надежных данных подсчета клеток в присутствии цитостатических препаратов, без достижения слияния необработанных клеток.Чтобы изучить, в какой степени разъединение АТФ/клетки зависит от времени, повторные планшеты анализировали в разное время с использованием этопозида и гемцитабина. Поскольку мутационный статус p53 потенциально является основным фактором, определяющим кинетику и характер ответа на лечение препаратами, нацеленными на ДНК, мы исследовали клетки A375 (p53 wt), а также клетки HT29 (p53-null). Чтобы поддерживать подходящую плотность клеток в конечной точке анализа, планшеты засевали с разной плотностью, затем обрабатывали в течение 24, 48 и 72 часов перед обработкой для визуализации и анализа АТФ.

    Данные

    EC 50 и E max для АТФ и количества клеток доза-реакция в разное время лечения суммированы на фигуре 8A. На фигурах 8B и 8C показаны соответствующие кривые доза-реакция для этопозида и гемцитабина. С увеличением времени наблюдалась значительно лучшая сходимость кривых количества клеток и АТФ, с увеличением значений анализа АТФ E max и некоторым сдвигом кривых влево. Для сравнения, значения количества клеток EC 50 были относительно постоянными, в то время как значения E max увеличивались со временем.Примечательно, что клетки НТ29, обработанные в течение 24 часов гемцитабином или этопозидом, показывают увеличение по сравнению с контролем сигнала анализа АТФ. В то время как через 48 часов не наблюдалось достаточного снижения сигнала анализа АТФ НТ29, чтобы получить значение EC 50 , ответ АТФ НТ29 был подобен А375 через 72 часа. Конвергенция и увеличение Emax для гемцитабина были связаны с увеличением фракции суб-G1 (рис. 8E), что свидетельствует о зависящем от времени прогрессировании от остановки клеточного цикла до апоптоза.Для A375 фракция суб-G1 через 48 часов была выше, чем у клеток HT29, что соответствовало меньшей разнице между АТФ и числом клеток.

    Рисунок 8. Зависимость от времени расхождений между числом клеток и анализом АТФ.

    A. Значения EC 50 и E max Клетки HT29 и A375, обработанные этопозидом или гемцитабином в течение указанных периодов времени, анализировали с помощью АТФ и анализов с высоким содержанием, как описано. ND, не определено – невозможно было установить достоверную кривую согласно стандартным критериям приемлемости, описанным в методах.Анализ кривых доза-реакция ( B, C ) и профилей клеточного цикла ( D, E ) для клеток A375 и HT29, обработанных этопозидом ( B, D ) и гемцитабином ( C, E ).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g008

    Обсуждение

    Мы стремились разработать высокопроизводительный анализ для изучения как антипролиферативной активности, так и механизма действия препаратов, воздействующих на клеточный цикл. Высокопроизводительная микроскопия позволяет проводить прямой подсчет клеток.Оптимизация условий подготовки образцов (фиксация, пермеабилизация и окрашивание) и анализа изображений позволила провести одноэтапный анализ без промывки, который также является количественным для содержания ДНК и, следовательно, распределения клеточного цикла. Окрашивание MitoTracker требовало только дополнительной стадии добавления реагента, поскольку конфокальная визуализация практически исключала фоновую флуоресценцию. Устранение каких-либо требований к этапам аспирации или промывки также значительно облегчит реализацию этого анализа в 1536-луночном формате.

    Более сложные методы обнаружения и анализа (например, иммуноокрашивание белков и фосфоэпитопов, регулируемых клеточным циклом, множественная ядерная морфология, параметры текстуры и интенсивности) использовались для идентификации субпопуляций клеточного цикла с помощью анализа высокого содержания (например, [28 ]–[34]). Однако мы решили использовать монопараметрический биннинг содержимого ДНК по нескольким причинам. Одной из ключевых целей оптимизации протокола без промывки было обеспечение сохранения всех клеток, включая отслоившиеся и фрагментированные апоптотические клетки, поэтому иммуноокрашивание невозможно.Дифференцировать G2 от М-клеток на основе ядерной морфологии можно с помощью измеренного нами параметра анализа на уровне клеток (см., например, [22]), но во многих случаях обработка соединениями приводит к аномальным морфологиям, которые не соответствуют ни одной из найденных популяций. в необработанных клетках.

    Сравнение прямого подсчета клеток с двумя широко используемыми анализами «пролиферации», основанными на клеточном метаболизме; Содержание АТФ и активность MTS-редуктазы выявили общий и значительный артефакт, заключающийся в том, что в условиях остановки клеточного цикла предполагаемая линейная зависимость между сигналом анализа и количеством клеток нарушается.Среднее количество АТФ (судя по повышенной биолюминесценции люциферазы/люциферина) или MTS-снижающей активности на клетку значительно увеличивается. Это увеличение коррелирует и может быть объяснено лекарственным увеличением размера клетки на клетку и, следовательно, содержания митохондрий.

    Для сравнения, оценка количества жизнеспособных клеток с использованием общей флуоресценции ДНК (анализ CyQuant) была менее подвержена отклонению от фактического количества клеток. В предыдущих исследованиях также сообщалось о различиях в определении числа клеток между количественным определением ДНК и анализами на основе метаболизма [1], [35], [36].Однако обработки, которые значительно изменили среднее содержание ДНК на клетку, вызывая остановку митоза и/или эндоредупликацию, также приводили к недооценке процентного изменения числа клеток с помощью анализа CyQuant.

    В целом изменения в клеточном содержании АТФ и активности MTS приводили к одному из двух типов отклонений между числом клеток и анализом АТФ/MTS. Во-первых, были случаи, когда E max был сильно снижен, т.е. были очень пологие кривые доза-реакция. Например, гемцитабин снижает сигнал АТФ для клеток НТ29 примерно на 20%, тогда как на самом деле количество клеток уменьшилось на 80% по сравнению с контролем.Другую ситуацию иллюстрирует этопозид, где EC 50 смещен вправо, но кривые доза-реакция сходятся к аналогичному E max при достаточно высокой концентрации. Это может привести к недооценке антипролиферативной активности в 10 и более раз. VX-680 представляет собой промежуточный случай, когда имеется двухфазная кривая АТФ с промежуточным плато, соответствующим повышенному соотношению АТФ/клетки, за которым следует второе снижение. Подобные кривые плохо соответствуют стандартной 4-параметрической модели, если вообще соответствуют, и могут привести к очень противоречивым результатам с точки зрения как EC 50 , так и E max .

    Эти разные профили ответа можно объяснить механизмами действия этих соединений: многие из этих препаратов имеют двухфазный клеточный цикл доза-реакция. Во-первых, целевые антипролиферативные или цитостатические ответы совпадают со снижением абсолютного числа клеток, но с небольшой гибелью клеток. В этих условиях арестованные клетки увеличиваются в размерах и митохондриальном составе, соответственно увеличивается количество АТФ на клетку. При более высоких концентрациях препарата фенотип популяции может стать менее исключительно цитостатическим, в зависимости от клеточной линии и времени лечения.С увеличением доли позднего апоптоза (суб-G1) средняя интенсивность MitoTracker и АТФ и MTS на клетку снижаются. Например, для клеток HT-29 афидиколин и гемцитабин приводили к остановке S или G2 и повышению содержания митохондрий и АТФ на клетку в широком диапазоне концентраций, тогда как клеточные линии p53-дикого типа A375 и A549 подвергались фенотипическому переключению при более высоких концентрациях гемцитабина. , где значительно увеличенная увеличенная апоптотическая фракция коррелирует с меньшим средним уровнем АТФ на клетку.Этопозид, с другой стороны, индуцировал повышение активности АТФ и MTS и митохондриальной массы в ограниченном диапазоне концентраций во всех протестированных клеточных линиях. Это согласуется с двухфазным механизмом действия, ранее наблюдавшимся для этих препаратов [37], [38]: при более низких концентрациях репарируемые повреждения ДНК вызывают остановку в конце S или в контрольной точке G2 с минимальным апоптозом и, таким образом, накоплением митохондрий, АТФ и MTS. активности на клетку. При более высоких концентрациях повреждения ДНК накапливаются быстрее и распространяются, вызывая остановку и апоптоз раньше в S-фазе.Схожая картина двухфазного ответа объясняет двухступенчатые кривые, наблюдаемые с VX-680, где преобладающий фенотип переключается с цитостатической эндоредупликации на преобладающую остановку 4N и гибель клеток, возможно, связанную с нецелевой активностью, при более высоких концентрациях.

    Поведение анализа MTS в случае ингибитора MEK PD901 необычно тем, что уровень активности дегидрогеназы MTS на клетку увеличивается, но количество АТФ на клетку не изменяется при лечении лекарствами.Однако другие ингибиторы киназы; VX-680, BI-2536 и кризотиниб также вызывали большее несоответствие между анализом MTS и числом клеток, чем АТФ. Аналогичное наблюдение было зарегистрировано для иматиниба [39], генистеина [40] и фаслодекса [41]. Последние две работы также продемонстрировали повышенную митохондриальную активность и митохондриальную массу. Поскольку существует множество механизмов и клеточных локализаций активности тетразолий редуктазы [5], наблюдение, что некоторые виды лечения в этом исследовании могут привести к разрыву между изменениями массы митохондрий и снижением MTS (например,грамм. PD901) не является неожиданным. Механизм двухфазной индукции BI-2536 митохондриальной массы, АТФ и активности MTS при концентрациях, превышающих полностью эффективные антипролиферативные концентрации, явно отличался от других ингибиторов киназ и требует дальнейшего изучения.

    Имеется ряд сообщений о химиотерапевтических агентах, вызывающих увеличение митохондриальной массы, включая доксорубицин [10] и этопозид [9], [13], [42]. Для объяснения этого увеличения было предложено несколько различных механизмов.Fu et al [9] предположили прямую механистическую связь, при которой активированный АТМ фосфорилирует и активирует AMPK, тем самым усиливая митохондриальный биогенез. McGowan et al [41] продемонстрировали, что индукция остановки клеточного цикла за счет принудительной экспрессии p14ARF приводит к увеличению митохондриальной массы.

    Стоит отметить, что ни в одном из приведенных выше отчетов размер клетки не рассматривался как фактор изменений в митохондриальном составе, и, следовательно, не было возможности дифференцировать специфическое усиление митохондриального биогенеза от исходной митохондриальной пролиферации, продолжающейся в отсутствие клеточного деления.Последний механизм кажется правдоподобным для многих агентов, описанных в текущем исследовании. Аналогичное наблюдение было недавно опубликовано Kitami et al. [43, 44], где было показано, что многие соединения, идентифицированные при скрининге увеличения митохондриальной массы, соответственно увеличивают размер клеток.

    Также сообщалось о препаратах, нацеленных на микротрубочки, влияющих на функцию митохондрий посредством регуляции активности VDAC и ΔΨ уровнями свободного тубулина [11]. В текущем исследовании мы также наблюдали увеличение содержания АТФ, несмотря на небольшое снижение дыхательной активности (как OCR, так и ECAR) в клетках, обработанных паклитакселом.Однако мы наблюдали увеличение клеточных уровней АТФ при E max в ответ на препараты, стабилизирующие и дестабилизирующие микротрубочки, что позволяет предположить, что уровень свободного тубулина не является причиной. Наши данные подразумевают, что агенты, нацеленные на микротрубочки, увеличивают количество АТФ на клетку посредством механизма, который не связан с изменениями в размере клеток, в отличие от агентов, нацеленных на синтез ДНК, и ингибиторов митотической киназы.

    В то время как изменения дыхательной функции и потока четко контролируют скорость синтеза АТФ, менее ясно, когда изменения потока приводят к изменениям в стационарной концентрации АТФ, которая обычно находится под жестким контролем обратной связи [45].Взаимосвязь между митохондриальной массой, мембранным потенциалом и уровнями клеточного АТФ также может быть искажена из-за вариаций вклада гликолиза во внутриклеточный пул АТФ [46], [47], однако, за исключением PD901, мы не наблюдали изменений в OCR. /ECAR отношение.

    Таким образом, представляется, что существует множество механизмов, с помощью которых различные соединения могут давать противоречивые и вводящие в заблуждение результаты в прокси-анализах, основанных на энергетическом метаболизме, однако исследование конкретных механизмов выходит за рамки настоящего исследования.

    Это исследование также подчеркивает тот факт, что механизмы действия соединений и фенотипические реакции часто не подчиняются монотонному поведению доза-реакция. Соответственно, расхождения между абсолютным числом клеток и сигналами анализа АТФ или MTS могут сильно различаться в зависимости от тестируемой концентрации. Когда в прокси-анализах наблюдаются немонотонные кривые без оценки лежащих в их основе механизмов действия, не только ухудшается качество данных EC 50 , но и теряется ценная информация о механизме действия.Существует также потенциальный значительный риск ложноотрицательных результатов при использовании анализов АТФ или MTS либо для скрининга соединений на антипролиферативную активность, либо для клеточных линий на чувствительность к соединениям, особенно если механизмы действия соединений и влияние на клеточный цикл, метаболическую активность и выживания не совсем понятны. Мы показываем, что увеличение времени обработки соединением может уменьшить разницу между показаниями прокси-анализа и фактическим количеством клеток, позволяя большему количеству клеток перейти к апоптозу.Однако это происходит за счет потери информации MoA. Еще одно обоснование взаимодополняемости абсолютного подсчета клеток и метаболических прокси-анализов демонстрируется определением зависимых от дозы, соединения и клеточной линии изменений значения АТФ/клетки, что может дать дополнительное представление о механизмах действия соединений. .

    Таким образом,

    Визуализация с высоким содержанием, даже простое окрашивание ДНК, не только дает более точную информацию о количестве жизнеспособных клеток, но также предоставляет несколько параметров, которые позволяют лучше понять механизм действия соединения и гетерогенность ответа.Простота процедуры окрашивания и отсутствие стадий промывки также делает этот подход очень подходящим для высокопроизводительного скрининга и составления профилей соединений как в 384-, так и в 1536-луночном формате.

    Дополнительная информация

    Рисунок S1.

    Профили клеточного цикла доза-реакция. Клетки на тех же изображениях, которые использовались для прямого подсчета клеток, были классифицированы по пяти ячейкам клеточного цикла по интегральной интенсивности ДНК. Столбцы с накоплением показывают относительную частоту субпопуляций при указанных концентрациях.Каждый бар представляет собой среднее значение двух лунок. Черные кружки обозначают относительный номер ячейки.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s001

    (TIFF)

    Рисунок S2.

    Кривые доза-реакция для количества клеток, сигналов анализа АТФ и MTS. Повторные планшеты с клетками HT29 обрабатывали, как указано, в течение 48 часов, а затем анализировали с помощью анализа АТФ или MTS или подсчета клеток с высоким содержанием. А . Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки), анализа АТФ (RLU) (синие треугольники) и анализов MTS (E 490 ) (зеленые квадраты), линии указывают соответствие 4-параметрической логистической модели.Если линия не показана, регрессия не привела к получению кривой, отвечающей критериям приемлемости.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s002

    (TIFF)

    Рисунок S3.

    Сравнение площади клеток и содержания митохондрий в клетках, обработанных лекарственными препаратами. Варьирование площади клеток и содержания митохондрий (интегрированная интенсивность глубокого красного цвета MitoTracker) для одних и тех же клеточных популяций, нормированное как кратное изменение относительно средней площади и интенсивности образцов, обработанных ДМСО.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s003

    (TIFF)

    Рисунок S4.

    Метаболические эффекты медикаментозного лечения. клеток HT29 обрабатывали указанными соединениями ((этопозид, 10 мкМ; гемцитабин 0,1 мкМ; паклитаксел 0,01 мкМ; PD901 1 мкМ, VX-680 0,2 мкМ) в течение 24 часов перед анализом скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного подкисления. (ECAR) с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse XF96 Базовые скорости (черный цвет) определяли в указанные моменты времени перед добавлением олигомицина (зеленый цвет), а затем FCCP (красный цвет).Данные скорости нормализуются к количеству клеток на лунку, определяемому с помощью визуализации с высоким содержанием после анализа.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s004

    (TIFF)

    Таблица S1.

    Сравнение результатов анализа между форматами для панели клеточных линий. LogEC 50 и E max данные, определенные путем прямого подсчета клеток, анализов АТФ и MTS, а также оцененная митохондриальная масса на лунку (Mito) для указанных препаратов и клеточных линий. Цветовые шкалы показывают отклонение от количества клеток EC 50 и абсолютного E max .ND, достоверное соответствие кривой не может быть получено в соответствии с критериями, описанными в разделе «Материалы и методы».

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s005

    (EPS)

    Благодарности

    Авторы хотели бы поблагодарить внутренних и внешних рецензентов за их проницательные и конструктивные отзывы, Питера Тану за помощь в автоматизации и Джошуа Боумана за полезные обсуждения биогенеза и функции митохондрий.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: GKYC TLK DPP JGM.Выполнены опыты: GKYC TLK DP. Проанализированы данные: GKYC DP JGM. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: JM. Написал статью: GKYC JGM.

    Каталожные номера

    1. 1. Quent VMC, Loessner D, Friis T, Reichert JC, Hutmacher DW (2010)Расхождения между метаболической активностью и содержанием ДНК как инструмент для оценки пролиферации клеток в исследованиях рака. J Cell Mol Med 14: 1003–1013.
    2. 2. Крауч С.П., Козловски Р., Слейтер К.Дж., Флетчер Дж. (1993) Использование биолюминесценции АТФ в качестве меры клеточной пролиферации и цитотоксичности.J Immunol Methods 160: 81–88.
    3. 3. Мюллер Х., Кассак М.Ю., Визе М. (2004)Сравнение полезности анализов МТТ, АТФ и кальцеина для прогнозирования активности цитотоксических агентов в различных линиях раковых клеток человека. J Biomol Screen 9: 506-515.
    4. 4. Ханна Р., Бек М. (2001) Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток Celltiter-Glo™: чувствительный и быстрый метод определения жизнеспособности клеток. Заметки Promega Cell.
    5. 5. Берридж М., Херст П., Тан А. (2005) Тетразолиевые красители как инструменты в клеточной биологии: новое понимание их клеточного восстановления.ЕЖЕГОДНЫЙ ОБЗОР БИОТЕХНОЛОГИЙ 11: 127–152.
    6. 6. Denizot F, Lang R (1986)Быстрый колориметрический анализ роста и выживания клеток. Модификации процедуры окрашивания тетразолием, повышающие чувствительность и надежность. J Immunol Methods 89: 271–277.
    7. 7. Loveland BE, Johns TG, Mackay IR, Vaillant F, Wang ZX, et al. (1992) Валидация анализа красителя МТТ для подсчета клеток в пролиферативных и антипролиферативных анализах. Биохим Инт 27: 501–510.
    8. 8. Джонс Л.Дж., Грей М., Юэ С.Т., Хаугланд Р.П., Сингер В.Л. (2001)Чувствительное определение числа клеток с использованием анализа пролиферации клеток CyQUANT. J Immunol Methods 254: 85–98.
    9. 9. Fu X, Wan S, Lyu YL, Liu LF, Qi H (2008) Этопозид индуцирует АТМ-зависимый митохондриальный биогенез посредством активации AMPK. PLoS ONE 3: e2009.
    10. 10. Kluza J, Marchetti P, Gallego MA, Lancel S, Fournier C, et al. (2004) Митохондриальная пролиферация во время апоптоза, вызванного противоопухолевыми агентами: влияние доксорубицина и митоксантрона на раковые и сердечные клетки.Онкоген 23: 7018–7030.
    11. 11. Maldonado EN, Patnaik J, Mullins MR, Lemasters JJ (2010)Свободный тубулин модулирует потенциал митохондриальной мембраны в раковых клетках. Рак Res 70: 10192–10201.
    12. 12. Оропеса М., Ла Мата де М., Маравер Дж. Г., Кордеро М. Д., Котан Д. и др. (2011) Организация и поддержание сети апоптотических микротрубочек зависят от высоких уровней клеточного АТФ и возбуждения митохондрий. Апоптоз 16: 404–424.
    13. 13. Reipert S, Berry J, Hughes MF, Hickman JA, Allen TD (1995)Изменения митохондриальной массы в линии гемопоэтических стволовых клеток FDCP-mix после обработки этопозидом: корреляционное исследование с помощью многопараметрической проточной цитометрии, конфокальной и электронной микроскопии.Exp Cell Res 221: 281–288.
    14. 14. Реннер К., Амбергер А., Конвалинка Г., Кофлер Р., Гнайгер Э. (2003)Изменения митохондриального дыхания, митохондриального состава и размера клеток после индукции апоптоза в лейкозных клетках. Биохим Биофиз Acta 1642: 115–123.
    15. 15. Лундхольт Б.К., Скаддер К.М., Пальяро Л. (2003)Простой метод уменьшения краевого эффекта в клеточных анализах. J Biomol Screen 8: 566-570.
    16. 16. Solit DB, Garraway LA, Pratilas CA, Sawai A, Getz G, et al.(2006) Мутация BRAF предсказывает чувствительность к ингибированию MEK. Природа 439: 358–362.
    17. 17. Gysin S, Lee SH, Dean NM, McMahon M (2005)Фармакологическое ингибирование передачи сигналов RAF-> MEK-> ERK вызывает остановку клеточного цикла рака поджелудочной железы посредством индуцированной экспрессии p27Kip1. Рак Рез 65: 4870–4880.
    18. 18. Harrington EA, Bebbington D, Moore J, Rasmussen RK, Ajose-Adeogun AO, et al. (2004) VX-680, мощный и селективный низкомолекулярный ингибитор киназ Aurora, подавляет рост опухоли in vivo.Природная медицина 10: 262–267.
    19. 19. Cui JJ, Tran-Dubé M, Shen H, Nambu M, Kung PP и др. (2011)Структурный дизайн кризотиниба (PF-02341066), мощного и селективного двойного ингибитора киназы мезенхимально-эпителиального переходного фактора (c-MET) и киназы анапластической лимфомы (ALK). J Med Chem 54: 6342-6363.
    20. 20. Steegmaier M, Hoffmann M, Baum A, Lénárt P, Petronczki M, et al. (2007) BI 2536, мощный и селективный ингибитор полоподобной киназы 1, ингибирует рост опухоли in vivo.Curr Biol 17: 316–322.
    21. 21. Ленарт П., Петронски М., Стигмайер М., Ди Фиоре Б., Липп Дж. Дж. и др. (2007) Низкомолекулярный ингибитор BI 2536 раскрывает новое понимание митотической роли поло-подобной киназы 1. Curr Biol 17: 304–315.
    22. 22. Sutherland JJ, Low J, Blosser W, Dowless M, Engler TA, et al. (2011)Надежный подход к визуализации с высоким содержанием для исследования механизма действия и фенотипических результатов модуляторов клеточного цикла. Мол Рак Тер 10: 242–254.
    23. 23. Munshi N, Jeay S, Li Y, Chen CR, France DS, et al. (2010) ARQ 197, новый и селективный ингибитор тирозинкиназы человеческого рецептора c-Met с противоопухолевой активностью. Мол Рак Тер 9: 1544–1553.
    24. 24. Basilico C, Pennacchietti S, Vigna E, Chiriaco C, Arena S и др. (2013) Тивантиниб (ARQ197) проявляет цитотоксическую активность, которая не зависит от его способности связывать МЕТ. Клин Рак Рез. doi: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-12-3459.
    25. 25.Cottet-Rousselle C, Ronot X, Leverve X, Mayol JF (2011)Цитометрическая оценка митохондрий с использованием флуоресцентных зондов. Цитометрия А 79: 405–425.
    26. 26. Джонсон И., редактор (2011 г.) Зонды для митохондрий — раздел 12.2. Справочник по молекулярным зондам — руководство по флуоресцентным зондам и технологиям мечения.
    27. 27. Posakony JW, England JM, Attardi G (1977)Митохондриальный рост и деление во время клеточного цикла в клетках HeLa. J Cell Biol 74: 468–491.
    28. 28. Лайман С.К., Кроули С.К., Гонг Р., Адамкевич Дж.И., МакГрат Г. и др. (2011) Высокопроизводительный высокопроизводительный анализ нарушений клеточного цикла, вызванных ингибитором HSP90 XL888. PLoS ONE 6: e17692 .
    29. 29. Нейманн Б., Вальтер Т., Херише Дж. К., Булкешер Дж., Эрфле Х. и др. (2010) Фенотипическое профилирование генома человека с помощью покадровой микроскопии выявляет гены клеточного деления. Природа 464: 721–727.
    30. 30. Feng Y, Mitchison TJ, Bender A, Young DW, Tallarico JA (2009)Многопараметрическое фенотипическое профилирование: использование клеточных эффектов для характеристики низкомолекулярных соединений.Nat Rev Drug Discov 8: 567–578.
    31. 31. Лу Л.Х., Лин Х.Дж., Штайнингер Р.Дж., Ван И, Ву Л.Ф. и др. (2009) Подход к расширенному профилированию молекулярных состояний клеточных субпопуляций. Нат Методы 6: 759–765.
    32. 32. Perlman ZE, Slack MD, Feng Y, Mitchison TJ, Wu LF и др. (2004) Многомерное профилирование лекарств с помощью автоматизированной микроскопии. Наука 306: 1194–1198.
    33. 33. Ньюман Р. Х., Чжан Дж. (2008) Фуччи: уличные фонари на пути к митозу.Химическая биология 15: 97–98.
    34. 34. Gasparri F, Ciavolella A, Galvani A (2007)Профилирование ингибиторов клеточного цикла с помощью анализа высокого содержания. Успехи экспериментальной медицины и биологии, Vol. 604: 137–148.
    35. 35. Heng BC, Das GK, Zhao X, Ma LL, Tan TTY и др. (2010)Сравнительная оценка цитотоксичности наноматериалов лантаноидов на клеточных линиях мыши и человека с помощью метаболических и количественных анализов ДНК. Биоинтерфазы 5: FA88–FA97.
    36. 36. Ван П., Хеннинг С.М., Хебер Д. (2010)Ограничения анализов на основе МТТ и МТС для измерения антипролиферативной активности полифенолов зеленого чая.ПЛОС ОДИН 5: e10202 .
    37. 37. Сакауэ-Савано А., Кобаяши Т., Охтава К., Мияваки А. (2011)Вызванная лекарствами модуляция клеточного цикла, приводящая к остановке клеточного цикла, неправильной сегрегации ядер или эндорепликации. BMC Cell Biol 12: 2 .
    38. 38. Монтекукко А., Биамонти Г. (2007)Клеточный ответ на лечение этопозидом. Рак Летт 252: 9–18.
    39. 39. Sims JT, Plattner R (2009) Анализы MTT нельзя использовать для изучения влияния STI571/Gleevec на жизнеспособность клеточных линий солидных опухолей.Cancer Chemother Pharmacol 64: 629–633.
    40. 40. Pagliacci MC, Spinozzi F, Migliorati G, Fumi G, Smacchia M, et al. (1993) Генистеин ингибирует рост опухолевых клеток in vitro, но усиливает митохондриальное восстановление солей тетразолия: еще одна ошибка при использовании анализа МТТ для оценки роста и выживания клеток. Евр J Рак 29A: 1573–1577.
    41. 41. McGowan EM, Alling N, Jackson EA, Yagoub D, Haass NK, et al. (2011)Оценка остановки клеточного цикла в чувствительных к эстрогену клетках рака молочной железы MCF-7: подводные камни анализа MTS.PLoS ONE 6: e20623 .
    42. 42. Рудольф К., Червинка М., Рудольф Э. (2009)Цитотоксичность и митохондриальный апоптоз, индуцированные этопозидом в клетках меланомы. Рак Инвест 27: 704–717.
    43. 43. Китами Т., Логан Д.Дж., Негри Дж., Хасака Т., Толлидей Н.Дж. и др. (2012) Химический скрининг, исследующий взаимосвязь между содержанием митохондрий и размером клетки. PLoS ONE 7: e33755 .
    44. 44. Вагнер Б.К., Китами Т., Гилберт Т.Дж., Пек Д., Раманатан А. и др. (2008)Крупномасштабное химическое вскрытие митохондриальной функции.Nat Biotechnol 26: 343–351.
    45. 45. Brand MD, Nicholls DG (2011)Оценка митохондриальной дисфункции в клетках. Biochem J 435: 297–312.
    46. 46. Кушнарева Ю., Ньюмейер Д.Д. (2010) Биоэнергетика и гибель клеток. Ann NY Acad Sci 1201: 50–57.
    47. 47. Buchakjian MR, Kornbluth S (2010)Двигатель корабля: метаболическое управление пролиферацией и гибелью клеток. Nat Rev Mol Cell Biol 11: 715–727.

    Анализ производительности производственной линии в производственной структуре MTS/MTO: подход теории массового обслуживания

    1.Введение

    Баланс спроса и предложения был одной из самых важных проблем в производственных компаниях в последние десятилетия. Производственные компании ищут подход к управлению запасами и поставками, который может получить максимальную выгоду от инвестиций в сырье, незавершенное производство и запасы готовой продукции (Donath, 2002). Как обсуждалось Wu & Olson (2008) и Wang (2009), хранение готовой продукции, отсроченные заказы, дефицит и утилизация устаревших и просроченных продуктов являются наиболее распространенными затратами на запасы в производственной системе.

    Многие из упомянутых выше затрат на запасы связаны с использованием стратегии МТС, когда компания производит готовую продукцию на основе своего прогноза рыночного спроса. Наиболее важной особенностью стратегии MTS является получение более высоких показателей удовлетворенности заказами по сравнению с другой стратегией, производством на заказ (MTO). Стратегия MTS предлагает меньшую возможность настройки, но менее дорогие продукты по сравнению со стратегией MTO. С другой стороны, такие проблемы, как более высокая средняя задержка заказа, более высокое среднее время отклика и установка срока выполнения, рассматриваются как проблемы производственных систем MTO.Эти системы предлагают более дорогие продукты из-за большего разнообразия пользовательских настроек (Soman et al., 2004).

    Исследуемая система пытается сочетать стратегии производства на складе (MTS) и производства на заказ (MTO), чтобы извлечь выгоду из обеих производственных систем. Эта идея развивается путем применения точки проникновения заказа (OPP) на производственных линиях. Основная идея использования такой точки в производственных системах чаще всего затрагивается в научных статьях в области управления цепочками поставок.Эта точка определяется как точка цепочки поставок, где каждый продукт предназначен для конкретного заказа известного клиента (Olhager, 2003). Чтобы подчеркнуть, что этот момент напрямую связан с заказом клиента, некоторые исследователи рассматривали его как точку разделения заказа клиента (CODP). Использование OPP в производственных линиях показано на рисунке 1.


    Рисунок 1
    Различные стратегии доставки продуктов связаны с различными точками проникновения заказов (OPP). Пунктирные линии изображают производственную деятельность, управляемую прогнозами, тогда как прямые линии изображают деятельность, ориентированную на заказы клиентов (Olhager, 2003).

    В последние десятилетия позиционирование OPP широко изучается как сложная проблема в управлении цепочками поставок. Тем не менее, рассмотрение этой концепции в производственных системах для сравнения различных производственных стратегий (MTS/MTO) еще не получило широкого изучения. В связи с этим, выполнив поиск в «scholar.google.com», чтобы найти статью со словами «Производство» и «Точка проникновения заказа» в названии, мы не можем найти ни одной статьи. По лучшим сведениям авторов (занимающихся исследованиями в этой области около 10 лет), наиболее близким исследованием является глава книги Süer & Lobo (2011), где они рассматривали гибридные стратегии в клеточных системах.В их исследовании сравнивались подключенные и отключенные сотовые системы на примере компании-производителя медицинского оборудования и моделировались различные сценарии для сравнения двух компаний-производителей сотовой связи.

    Целью этой статьи является показать, как производственные компании могут применять OPP для получения выгод от стратегий MTS и MTO в соответствии с различными стоимостными параметрами производственных линий. Кроме того, использование концепций теории массового обслуживания для моделирования изучаемой проблемы помогает учитывать внешние факторы, такие как нетерпеливые клиенты и неопределенность поступления спроса, которые могут повлиять на показатели производительности системы, помимо внутренних факторов, таких как производительность и затраты, связанные с запасами.В реальной производственной среде возможно, что компания хочет расширить производственную линию после определенной станции и иметь больше линий настройки для повышения удовлетворенности клиентов. Эта идея множественной линии индивидуальной настройки также изучается в этом исследовании.

    Остальная часть статьи организована следующим образом. Соответствующая литература по различным применениям OPP как в научных кругах, так и в промышленности рассмотрена в Разделе 2. Раздел 3 посвящен описанию фокуса этого исследования и определению обозначений для моделирования проблемы.Раздел 4 формулирует задачу и представляет метод решения. Численный пример с обширным анализом чувствительности представлен в Разделе 5, а Раздел 6 завершает исследование и обсуждает будущие пути исследования.

    2. Обзор литературы

    За последние два десятилетия разработка новых производственных стратегий, таких как производство MTS/MTO, привлекла к себе большое внимание исследователей, чтобы выявить несоответствие между реальным рыночным спросом и прогнозируемым спросом. Точка дифференциации между стратегиями MTO и MTS известна в литературе как точка проникновения заказа (OPP) (Olhager, 2003), и определение OPP стало важным стратегическим решением в цепочках поставок и производственных системах в соответствии с его возможностями для сокращения управления запасами. расходы.Терминология точки развязки (DP) (Sharman, 1984) и точки развязки заказа клиента (CODP) (Hoekstra & Romme, 1992) упоминается в литературе для обозначения одного и того же понятия.

    По данным Herer et al. (2002), OPP отличает часть производственной системы, отвечающую требованиям клиентов, от части стратегического планирования. Со стратегической точки зрения есть два фактора, обнадеживающих использование OPP в конечных процессах производственной линии: сокращение времени выполнения заказа и повышение эффективности производства.В таблице 1 представлены преимущества и недостатки смещения ОПП ближе к концу производственной линии:

    Таблица 1

    Стратегические вопросы, причины и негативные последствия смещения ОПП вперед (Olhager, 2003).

    С другой стороны, основная причина перемещения OPP в сторону основных процессов производственной линии заключается в том, чтобы получить больше информации о спецификациях заказов клиентов в период производства, что расширяет возможности настройки и снижает объем доработок. -процесс.В таблице 2 представлены преимущества и недостатки переноса OPP на первые машины производственной линии.

    Таблица 2

    Стратегические вопросы, причины и негативные последствия смещения ОПП назад (Olhager, 2003).

    Концепция использования гибридного производства помимо чистого MTO в задаче планирования разработана Wu et al. (2008) для поддержания высокой загрузки машин. В их исследовании был предложен метод планирования для гибридной производственной системы с характеристиками машинного обучения.Целью представленной модели является достижение высокой пропускной способности для продуктов МТС и высокой своевременности доставки для продуктов МТО.

    Недавнее исследование, проведенное Olhager & Prajogo (2012), сравнило фирмы, производящие продукцию на заказ и на складе, путем изучения данных 216 австралийских производственных компаний. Показано, что системы MTO оказывают определенное влияние на интеграцию поставщиков для повышения эффективности бизнеса, но это не относится к рационализации поставщиков и методам бережливого производства.

    Концепции теории массового обслуживания применяются для нахождения OPP в исследовании Teimoury et al. (2012) . Они рассмотрели многопродуктовую производственную систему MTS/MTO, которая имеет вероятностное распределение как для прибытия клиентов, так и для производства полуфабрикатов. Чжан и др. (2013) использовали теорию очередей для динамического объединения операций MTS и MTO. В их модели подмножество машин динамически переключается между двумя стратегиями. Они количественно оценили показатели производительности системы, разработав аналитическую формулу.Этот подход минимизирует общие затраты на систему с учетом ограничений, связанных с удовлетворенностью клиентов.

    Проблема анализа производительности в производственных системах MTS/MTO изучается Almehdawe & Jewkes (2013). Это исследование больше посвящено стоимости запасов, включая политику пополнения запасов и группового заказа.

    В таблице 3 представлено краткое введение в последние исследования OPP в различных аспектах систем производства и обслуживания:

    Таблица 3

    Некоторые из OPP опубликовали статьи с 2008 по 2016 год.


    Точка зрения настоящего исследования аналогична точке зрения Teimoury et al. (2012), где авторы использовали матричный геометрический метод очередей (MGM) для поиска OPP в двухэтапной цепочке поставок. Математические модели в литературе по производству MTS/MTO обычно пытаются найти оптимальный баланс между уровнями удовлетворенности клиентов и стоимостью запасов, но, насколько известно авторам, простои системы и многочисленные линии настройки в литературе еще не изучались.

    3. Описание проблемы

    Для описания задач и математического моделирования используются следующие обозначения:

    Переменные решения:

    θ Процент завершения продукции на первых g станциях

    T Количество производственных линий после ОПП

    g Количество станций до OPP

    Параметры:

    λ Скорость поступления заявок в систему

    м Количество станций в производственной линии

    μ Производительность линии с одним станком на каждой станции

    S Буферная емкость хранения полуфабрикатов

    V(θ) За единицу стоимости θ % готового полуфабриката

    DD Средняя дата выполнения заказа конкретного клиента

    α Скорость наладки на машину при использовании производства MTO

    τ Постоянная доля общей задержки выполнения заказа клиента

    CK Стоимость содержания полуфабриката

    CH Холдинговая стоимость готовой продукции (Производство на чистом МТС)

    CLO Стоимость потери одного клиента (из-за уклонения или отказа)

    CB Стоимость дозаказа при отсутствии полуфабриката в буфере для удовлетворения заказов

    CD Стоимость выполнения заказа после срока его исполнения

    КИ Стоимость простаивающих машин в линии МТО

    CT Стоимость строительства новой линии кастомизации после буфера полуфабрикатов

    Рассмотрим производственную линию с m станциями, где заказы клиентов поступают на линию в соответствии с распределением Пуассона со скоростью λ .Время производства линии с одним станком на каждом участке (m станков) предполагается экспоненциально распределенным с параметром µ (обозначения выбраны такие же, как и во многих статьях в литературе по назначению) (Jewkes & Alfa, 2009). В стратегии MTS нет времени на настройку машин, поскольку они работают в обычном режиме, и никаких изменений не требуется. Если машина назначена для настройки полуфабриката, для каждого продукта будет одинаковое время настройки со скоростью α на каждой машине (все время обработки и настройки подчиняются экспоненциальному распределению).Предполагается, что ограничений по сырью нет. Производитель предпочитает производить полуфабрикаты, которые производятся на первых g станциях (g

    Согласно приведенным выше объяснениям, время, необходимое для изготовления полуфабриката на основе конкретного спроса, подчиняется экспоненциальному распределению со средним значением 1/(μ/(1−θ))+1/(α/(m−g)) которое не зависит от существующих клиентов в системе, а время, необходимое для завершения полуфабриката на основе MTS, подчиняется экспоненциальному распределению со средним значением 1/(μ/(1−θ)) . Следуя той же логике, производство полуфабрикатов на первых g машинах подчиняется экспоненциальному распределению со средним значением 1/(μ/θ) .Примечательно, что θ относится к совокупному проценту завершения продукта на первых g машинах. Мы также используем значение на единицу функции V(θ), введенное Jewkes & Alfa (2009). Эта функция является возрастающей функцией θ, которая используется для получения затрат на хранение запасов.

    Примечательно, что настройка полуфабрикатов может быть выполнена с помощью T производственных линий после OPP. Точнее говоря, чтобы увеличить скорость обслуживания при завершении полуфабрикатов и сократить время ожидания, завод-изготовитель может возобновить производство после OPP с более чем одной производственной линией, что является переменной решения в текущем исследовании.Затраты на строительство новой линии являются убывающей функцией θ, поскольку при увеличении θ более высокий процент продукции завершается до OPP, а количество оставшихся перерабатывающих станций уменьшается. Логично, что для строительства меньшего количества станций нужны меньшие инвестиции.

    Клиенты этой производственной линии имеют характеристики нетерпеливых клиентов, в том числе упирающихся и отказывающихся. По прибытии в очередь клиент может обнаружить n клиентов, уже стоящих в очереди (включая обслуживаемого в данный момент).Прибывший клиент может принять решение входить в очередь с вероятностью Pn или не входить в очередь с вероятностью ( 1−Pn ) (что в теории массового обслуживания называется отказом). Согласно Бхату (2008), Pn можно получить следующим образом:

    Pn = {1 n = 0, e-n / (μ / (1-θ)) 1≤n≤n-1,0 n = n (1)

    Клиенты, находящиеся в очереди, могут проявить нетерпение и выбежать из очереди, не будучи обслуженными (что в теории массового обслуживания называется отказом от обслуживания).Это время ожидания подчиняется экспоненциальному распределению со средним значением 1/β (Teimoury et al., 2012). Из-за независимости решения клиентов и принципов экспоненциального распределения делается вывод, что средний уровень отказов в текущей системе равен nβ (где n — количество клиентов в системе).

    Цель состоит в том, чтобы достичь следующих целей по двум сценариям: 1- Получение лучшего места для буфера полуфабрикатов (OPP). 2- Сравнение стоимости производства MTS/MTO и производства MTS/MTO плюс MTS, когда в системе нет конкретного заказа.3- Нахождение оптимального количества строк настройки после места ОПП.

    3.1. Сценарий 1

    В первом сценарии полуфабрикаты производятся первыми g машинами (g
    Рисунок 2
    Чистая производственная система «Изготовление на склад»/«Изготовление на заказ» (MTS = «Изготовление на склад»; MTO = «Изготовление на заказ».

    3.2. Сценарий 2

    Во втором сценарии мы используем и МТС, и МТО для комплектации полуфабрикатов. При отсутствии клиента в системе полуфабрикаты комплектуются по стратегии МТС, а готовая продукция отправляется на склад. Но когда поступает заказ на настройку, полуфабрикат назначается этому заказу, и после завершения текущего задания MTS на каждой машине это задание MTO начинает выполнять полуфабрикат.Производственная система второго сценария может быть показана на рисунке 3.


    Рисунок 3
    Производственная система «Изготовление на склад»/«Изготовление на заказ» со стратегиями завершения «Производство на склад» и «Изготовление на заказ» после точки проникновения заказа (MTS = Изготовление на склад; MTO = Изготовление на заказ).

    Существует большое различие между двумя сценариями, когда полуфабрикаты присутствуют в системе, но нет клиента, которому нужно было бы получить обслуживание. Здесь конфликт между стоимостью простоя и стоимостью запасов должен быть уравновешен выбором одного из вышеперечисленных сценариев.В Разделе 4 основные части формулировки проблемы и подхода к решению представлены только для первого сценария, чтобы избежать лишнего текста. Также объясняются некоторые важные вопросы второго сценария.

    4. Формулировка проблемы и показатели эффективности системы

    Чтобы получить стоимость работы по каждому сценарию, необходимо найти показатели устойчивого состояния системы. Поскольку поступление заказов и получение полуфабрикатов носит вероятностный характер, для моделирования системы используется двумерная очередь.

    4.1. Диаграммы переходов состояний и уравнения баланса

    Система состоит из вероятностного прихода клиентов и полуфабрикатов, поэтому каждый такой приход может создавать очередь в производственной линии. Такая система может быть смоделирована квазимарковским процессом рождения и смерти с состояниями (n,k). Если n — количество клиентов в системе, из которых один обслуживается в данный момент, а k — количество полуфабрикатов, имеющихся в системе, можно рассмотреть цепь Маркова {(n,k), 0≤n≤ N, 0≤k≤S} для представления возможных состояний существующих продуктов и клиентов в системе.

    Чтобы смоделировать долгосрочные затраты текущей производственной линии, необходимо получить вероятности установившихся состояний π(n,k) для обоих сценариев. В соответствии с двумерным характером очереди мы используем матричный геометрический метод (MGM) и уравнения баланса очереди, чтобы найти устойчивые вероятности состояний продукта-покупателя в производственной линии (Neuts, 1981). Из-за основы MGM нам нужно определить образующую матрицу для представленной цепи Маркова следующим образом:

    Q = [b0 a0c1 b1 a1 ⋱ ⋱ ⋱ cn-1 bn-1 an-1 cn bn] (2)

    В этой матрице An , Bn и Cn являются блочными квадратными матрицами порядка S+1 .Эти матрицы представлены в Приложении A для получения дополнительных пояснений. An отображает скорость увеличения одного клиента в производственной линии, Bn (n≠0) отображает скорость, с которой количество клиентов остается на том же уровне (ни один заказ не поступает и не выходит), а Cn обозначает скорость уменьшения одного клиента в производственной линии. производственная линия. Наконец, B0 обозначает скорость увеличения количества клиентов с нуля до одного.

    Каждый стационарный вектор вероятности π для постоянного значения k может быть определен как π=[π0,π1,…,πN], где πn вычисляется как ∑n=0Nπn=1 и πQ=0 . πn=[π(n,0),π(n,1),…,π(n,S)] — вектор-строка размера 1×(S+1), где π(n,k) — устойчивая вероятность состояния, в котором на производственной линии имеется n покупателей и k полуфабрикатов. В каждом сценарии выводятся уравнения баланса, и, решив уравнение πQ=0, мы можем найти вероятности установившегося состояния и следующие показатели производительности системы. Используя все вышеизложенное, можно изобразить диаграмму стационарного состояния первого сценария, как показано на рисунке 4.


    Рисунок 4
    Диаграмма скоростей переходов состояний первого сценария.

    Где а – скорость превращения полуфабрикатов в готовую продукцию, равная Tμαα(1−θ)+μ(м−г) . Соответствующие уравнения баланса на рисунке 3 представлены в уравнениях с 3 по 11:

    .

    (Pnλ+µθ)π(n,k)=βπ(n+1,k)+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)π(n+1,k+1)                       =n=               0(3)

    (Pnλ+µθ)π(n,k)=βπ(n+1,k)+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)π(n+1,k+1)+µθπ(n,k −1)              n=0, 1≤k≤S−1(4)

    Pnλπ (n, k) = βπ (n + 1, k) + μθπ (n, k-1) n = 0, k = s (5)

    (Pnλ+nβ+µθ)π(n,k)=(n+1)βπ(n+1,k)+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)π(n+1,k+1 ) + PN-1λπ (N-1, k) 1≤n≤n-1, k = 0 (6)

    (Pnλ+nβ+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)+µθ)π(n,k)=(n+1)βπ(n+1,k)+Tµαα(1−θ)+µ (M-G) π (n + 1, k + 1) + pn-1λπ (n — 1, k) + μθπ (n, k-1) 1≤n≤n-1, 1≤k≤s-1 (7)

    (Pnλ+nβ+Tµαα(1−θ)+µ(m−g))π(n,k)=(n+1)βπ(n+1,k)+Pn−1λπ(n−1,k) + μθπ (n, k-1) 1≤n≤n-1, k = s (8)

    (nβ + μθ) π (n, k) = pn-1λπ (n-1, k) n = n, k = 0 (9)

    (nβ+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)+µθ)π(n,k)=Pn−1λπ(n−1,k)+µθπ(n,k−1)                      1=N ≤k≤S−1(10)

    (Nβ + Tμαα (1-θ) + μ (M — G)) π (n, k) = pn-1λπ (n — 1, k) + μθπ (n, k — 1) n = n, k = s (11)

    Согласно всей предыдущей информации, диаграмма устойчивого состояния второго сценария изображена на рисунке 5.


    Рисунок 5
    Диаграмма скорости перехода состояний второго сценария.

    Где а – скорость превращения полуфабрикатов в готовую продукцию, равная Tμαα(1−θ)+μ(м−г) . Мы можем использовать те же уравнения баланса, что и в сценарии 1, для сценария 2, но уравнения 3–5 имеют некоторые изменения в связи с дополнительными объемами производства МТС. Мы можем использовать уравнения с 12 по 14 для расчета вероятностей установившихся состояний, когда n=0.

    (Pnλ+µθ)π(n,k)=βπ(n+1,k)+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)π(n+1,k+1)+Tµ1−θπ(n ,k+1)                     n=0, k=0(12)

    (Pnλ+µθ+Tµ1−θ)π(n,k)=βπ(n+1,k)+Tµαα(1−θ)+µ(m−g)π(n+1,k+1)+µθπ (n, k-1) + Tμ1-θπ (n, k + 1) n = 0, 1≤k≤s-1 (13)

    (Pnλ + Tμ1-θ) π (n, k) = βπ (n + 1, k) + μθπ (n, k — 1) n = 0, k = s (14)

    Решая уравнения баланса очередей, можно найти вероятность простоя системы, а также вероятность состояний, что заявки ожидаются в системе, а в буфере нет полуфабриката.С помощью этих вероятностей мы можем определить целевую функцию, основанную на затратах, которая включает стоимость простаивающих машин, наличие запасов и задержку выполнения заказа.

    4.2. Меры по оценке эффективности

    Чтобы построить модели оптимизации для двух изучаемых сценариев, нам необходимо получить некоторые показатели производительности производственной линии с учетом вероятностей устойчивого состояния. В таблице 4 показаны применяемые показатели производительности в модели оптимизации.

    Таблица 4

    Показатели производительности производственной линии.


    Примечательно, что при отсутствии заказчика в системе во втором сценарии один из полуфабрикатов поступает на линию доработки на базе МТС и после изготовления этого изделия, если пришел заказчик с конкретным заказом в систему, линия начинает производить на МТО. Таким образом, при расчете E(H) вероятности устойчивого состояния умножаются на k=1.

    4.3. Модель первого Сценария

    Для построения математических моделей в этом исследовании подход Jewkes & Alfa (2009) и Teimoury et al.(2012). Целевая функция основана на определенных затратах системы. Общая стоимость системы должна быть минимизирована с учетом эксплуатационных ограничений системы. Математическая формулировка Сценария 1 выглядит следующим образом:

    Min(θ,T)=CKV(θ)E(K)+CLOE(LO)+CD(E(W)−DD)+CIT(m−g)E(I)+CBE(B)+CTT(24 )

    предмет:

    α(1−θ)+µ(m−g)Tµα≥τE(W)(25)

    0<θ<1(26)

    Т=1, 2, 3, …(27)

    Целевая функция 24 минимизирует общую стоимость хранения полуфабрикатов в буфере, стоимость потерянных клиентов, стоимость задержки в выполнении заказов клиентов, стоимость простоя Т-линий, стоимость невыполненных заказов и стоимость создания Т производственных линий по индивидуальному заказу.Ограничение 25 обозначает уровень обслуживания продукта, при котором ожидаемое время настройки α(1−θ)+μ(m−g)Tμα должно быть больше или равно части τ ожидаемого времени выполнения заказа. Ограничения 26 и 27 обозначают диапазон переменных модели. Применение метода перебора для нахождения всех возможных значений представленной модели позволяет нам узнать тенденцию затрат производственной линии и найти лучшее место для размещения буфера полуфабрикатов. Также можно найти оптимальное количество производственных линий по индивидуальному заказу, которые будут встроены в систему.Значения целевой функции в ответ на различные значения переменных решения используются для сравнения производительности первого сценария и второго сценария.

    4.4. Модель второго сценария

    Математическая формулировка Сценария 2 выглядит следующим образом:

    Min(θ,T)=CKV(θ)E(K)+CLOE(LO)+CD(E(W)−DD)+CHTE(H)+CBE(B)+CTT(28)

    предмет:

    α(1−θ)+µ(m−g)Tµα≥τE(W)(29)

    0<θ<1(30)

    Т=1, 2, 3, …(31)

    Целевая функция 28 минимизирует общую стоимость хранения полуфабрикатов в буфере, стоимость потерянных клиентов, стоимость задержки в выполнении заказов клиентов, стоимость хранения готовой продукции в МТС, стоимость невыполненных заказов и стоимость создания T производственных линий по индивидуальному заказу . Ограничение 29 обозначает уровень обслуживания продукта, при котором ожидаемое время настройки α(1-θ)+µ(m-g)Tµα должно быть больше или равно части τ ожидаемого времени выполнения заказа.Ограничения 30 и 31 обозначают диапазон переменных модели.

    В разделе 5 представлен численный пример, иллюстрирующий применимость представленных моделей, и выполнен обширный анализ чувствительности, чтобы понять, как система ведет себя в зависимости от различных значений параметров.

    5. Числовой пример

    Чтобы представить применимость представленной модели и метода решения, в этом разделе представлен численный пример с анализом параметров. Рассмотрим производственную линию с m=5 станциями, на каждой из которых обрабатывается 20 % готовой продукции.Вся производственная линия с одним станком на каждой станции изготавливает свою продукцию на основе экспоненциального распределения с параметром µ=1. Клиенты этой производственной линии входят в систему по распределению Пуассона со скоростью λ=0,9.

    Линейный руководитель хочет выбрать стратегию производства «Полное МТО», «Полное МТС» и «МТС/МТО» в соответствии со сценариями, представленными в разделе 4. По стоимостным параметрам системы желательно найти место для буфера полуфабрикатов ( нахождение θ как OPP) и количество производственных линий, которые можно добавить в качестве линий настройки продукта для повышения уровня обслуживания системы (нахождение T).Система позволяет находиться в очереди максимум N=10 клиентов (включая обслуживаемого), а мест для буферизации полуфабрикатов всего S=4. Клиенты системы нетерпеливы и могут войти в систему с вероятностью Pn, представленной Бхатом (2008), и после входа могут отказаться от обслуживания в соответствии с экспоненциальным распределением с параметром β = 0,2.

    Для каждой машины существует время настройки, если она хочет настроить продукт в соответствии с конкретным заказом, который подчиняется экспоненциальному распределению с параметром α=40 .У клиентов системы срок выполнения составляет DD=0,1 единицы времени, а за отсроченную настройку продукта предусмотрен штраф в размере CD=5, который является вознаграждением, если продукт будет завершен раньше срока. Клиенты так чувствительны к тому, что в очереди нет полуфабриката для кастомизации, но есть возможность отложить заказ стоимостью CB=20. Если клиент предпочитает не получать услугу с линии, когда в буфере нет полуфабриката, стоимость потери клиента будет равна CLO=6.Кроме того, буферизация полуфабрикатов на линии имеет стоимость СК=0,5 за штуку в единицу времени.

    Как обсуждалось в презентации модели, для каждого сценария существуют определенные затраты. Стоимость простоя каждой машины в сценарии 1 составляет CI=0,5, а стоимость хранения готовой продукции в сценарии 2 равна CH=0,5. Для системы существует постоянная доля задержки завершения, которая выбрана равной τ = 0,04 в соответствии с потребностями клиентов и рыночными характеристиками.

    Логично предположить, что стоимость хранения полуфабрикатов связана с процентом готовности продукта (Jewkes & Alfa, 2009), поэтому стоимость продукта следует уравнению V(θ)=θ% для каждого полуфабриката. продукт.Стоимость строительства новой линии после буфера полуфабрикатов также является убывающей функцией завершения производства. Мы можем использовать формат функции a*(1−bV(θ)) в качестве убывающей функции θ, а для текущей производственной линии стоимость строительства составляет CT=0,2*(1-(0,7*V(θ))) . Примечательно, что доступное пространство строки может быть использовано только для построения 5 строк настройки после места OPP ( Tmax = 5 ).

    Результаты решения этого численного примера с помощью MATLAB 7 представлены в таблице 5 .Как видно из таблицы 5, представленная модель хорошо работает для рассматриваемой производственной линии. В этом примере мы также хотим рассмотреть варианты Full MTO и Full MTS помимо производственной стратегии MTS/MTO, которая равна θ=0% для Full MTO и θ=100% для Full MTS. Поскольку наша формулировка не работает для значений θ, равных 0% и 100%, здесь θ=1% считается для расчета общей стоимости стратегии Full MTO, а θ=99% используется для расчета общей стоимости стратегии Full MTS. Примечательно, что единственное ограничение нашей модели привело к тому, что некоторые из наших решений вышли за пределы допустимого пространства решений, что показано NS в таблице 5.

    Таблица 5

    Результаты числового примера.


    Каждое значение T имеет оптимальную общую стоимость, которая показана курсивным подчеркнутым шрифтом, а лучший ответ для каждого сценария показан жирным шрифтом в таблице 5. Например, во втором сценарии производство на основе стратегии MTS/MTO для T = 5 является оптимальным (общая стоимость = 4,46) при условии, что на первой станции мы производим только 20% продукта. Но это не общий оптимальный случай для T = 5, и мы можем принять полную стратегию MTO с более низкой стоимостью производства, равной 4.38.

    В таблице 5 показан оптимальный процент завершения каждого полуфабриката с количеством линий завершения продукта после OPP. Как видно из первого сценария, две линии комплектации продукта — лучший вариант, исходя из значения функции затрат. Если мы рассмотрим две линии завершения после OPP, лучший процент завершения продукта до OPP составляет 60%, что означает размещение OPP после третьей станции. Следуя вышеупомянутому условию, принятие производственной стратегии MTS/MTO с двумя линиями завершения и производством 60% готовой продукции будет стоить 4.56 денежных единиц в устойчивом состоянии, что ниже, чем в стратегиях Full MTO и Full MTS из-за особенностей клиента и рынка.

    В первом сценарии общая стоимость и процент выполнения являются выпуклыми по T . Причину первоначального снижения общих затрат в T можно объяснить повышением уровня обслуживания клиентов. За счет увеличения T с одного до двух увеличится скорость кастомизации полуфабрикатов, а это уменьшит затраты на задержки выполнения заказов и недозаказы, которые произошли из-за более низкой скорости выполнения продуктов.Но когда мы увеличиваем T с двух до трех, мы видим, что общая стоимость системы увеличивается.

    Примечательно, что даже в этом случае уровень обслуживания снижает затраты за счет повышения скорости настройки, но создание новой линии завершения имеет свою стоимость, которая была представлена ​​формулой убывания θ . В случае перехода от двух линий кастомизации к трем линиям кастомизации связанные с этим затраты на создание новой производственной линии превышают сокращение затрат на обслуживание клиентов.Итак, мы видим, что общая стоимость системы начинает увеличиваться при создании более двух линий настройки продукта.

    Поведение θ также становится выпуклым при увеличении T . Логично, что с увеличением T скорость настройки становится быстрее, и система предпочитает выполнять больший объем работы в той части системы, которая работает с большей скоростью. Таким образом, когда T увеличивается с одного до двух, производственная линия предпочитает выполнять меньше работы до OPP, когда доступна только одна линия, и выполнять больший объем выпуска продукции после OPP, когда доступны две линии.

    Но с более быстрыми линиями клиенты будут получать более быстрое обслуживание, а время простоя системы в линии увеличивается. Это причина того, что общая стоимость увеличивается, когда Т увеличивается с двух до трех. Точнее говоря, когда в системе есть три линии настройки продукта, выполнение заказов клиентов выполняется очень быстро, и машины в трех линиях будут простаивать очень много. Из-за компромисса между преимуществами более быстрого завершения работы над продуктом и затратами на большее время простоя выпуклое поведение θ относительно T является разумным.

    Как показано на Рисунке 6, минимальная стоимость второго сценария относится к производственной линии с тремя линиями комплектации после OPP и производящей 40% полуфабрикатов. Более точно, место OPP во втором сценарии находится после второй станции, а оставшийся процесс выполняется в трех строках, каждая из которых имеет три станции. Согласно потребительским и рыночным характеристикам стоимость оптимального ответа во втором сценарии составляет 3,85 в устойчивом состоянии. Сравнивая затраты двух предложенных сценариев для этой производственной линии, показано, что второй сценарий имеет меньшую стоимость и лучше для системы производить готовую продукцию МТС, когда в системе нет клиента, и нести затраты на хранение готовой продукции. вместо того, чтобы нести расходы на простаивающие машины.


    Рисунок 6
    Производственная линия, относящаяся ко второму сценарию в числовом примере (MTS = Изготовление на склад; MTO = Изготовление на заказ).

    Во втором сценарии поведение общих затрат по отношению к увеличению T такое же, как и в первом сценарии, и его можно объяснить той же логикой. Но поведение θ при увеличении T не такое, как в первом сценарии. Во втором сценарии у системы нет простоев, и когда система опустеет от клиентов, она начнет производить на базе МТС.Таким образом, поскольку большее количество линий позволяет системе иметь более высокую производительность, система предпочитает выполнять меньше работы с низкой скоростью и больший объем работы с более высокой скоростью. Здесь нет превентивного фактора, такого как простаивающие машины, которые налагают затраты на систему, и θ уменьшается по мере того, как T получает более высокие значения.

    В этом разделе анализируется поведение некоторых других систем при различных значениях системных параметров, чтобы лучше показать применимость модели и прояснить концепцию. Более того, логичное поведение показателей производительности системы можно рассматривать как справедливость представленных расчетов и предложенной модели.

    5.1. Колебания общей стоимости в зависимости от колебаний λ

    Основное правило теории массового обслуживания состоит в том, чтобы считать скорость прибытия клиентов меньшей, чем скорость обслуживания системы, чтобы сделать систему стабильной; иначе очередь будет длинной и длинной до бесконечности. В текущем исследовании нет необходимости рассматривать такое правило из-за того, что наша система имеет конечную очередь, а также скорость обслуживания системы больше µ из-за нескольких строк настройки. Чтобы проанализировать поведение стоимости системы в зависимости от различных значений коэффициента прибытия клиентов, числовой пример выполняется для различных значений λ от 0.1 до 0,7 с шагом 0,2 по значению λ.

    По сходимости полной стоимости системы при увеличении λ дальше 0,7 не продвинулись. Но, как мы отметили, здесь мы можем даже рассматривать значения λ больше 1. Поведение затрат производственной линии по сценарию 1 представлено на рисунке 7 для возможных значений T и θ=60%.


    Рисунок 7
    Общая стоимость в зависимости от различных значений T и λ .

    Как видно на рисунке 7, для значений λ больше 0.1 наблюдается выпуклое поведение для общей стоимости, которое в значительной степени объясняется в решении текущего примера. Но для λ=0,1 мы видим прямую тенденцию к увеличению общей стоимости. Поскольку доля скорости поступления клиентов в скорость обслуживания системы увеличивается, логично, что производственной линии требуется более высокая скорость обслуживания для повышения уровня обслуживания. В случае λ=0,1 доля скорости прибытия клиентов в скорость обслуживания системы очень мала, поэтому затраты на строительство еще одной линии и увеличение значения простоя машин будут больше, чем выгода от удовлетворения клиентов, которую можно получить за счет 2 и более строк персонализации.В результате можно сделать вывод, что линия может обслуживать клиентов всего за одну линию настройки и наименьшую стоимость при λ=0,1. Для более высоких значений λ необходимо добавить еще одну строку настройки.

    Еще одной важной тенденцией является более высокая общая стоимость при более низких значениях λ при больших значениях T. Как видно, общая стоимость системы для T=5 и λ=0,1 составляет 6,97, а общая стоимость системы для T=5 и λ=0,7 равна 6,78. Такое поведение можно объяснить тем же компромиссом между уровнем обслуживания и стоимостью строительства новых линий.Иметь 5 линий настройки для системы с λ=0,1 невыгодно, поэтому мы видим, что большее количество линий настройки имеет меньшую стоимость за счет более эффективного использования их мощности. Примечательно, что с увеличением T разница между общей стоимостью производственной линии с λ=0,1 и λ=0,7 становится все больше и больше.

    5.2. Показатели производительности системы в зависимости от микрофлуктуаций

    Поскольку скорость прибытия клиентов оказывает определенное влияние на стоимость системы и ее производительность, изменение скорости производства также может повлиять на производительность системы.Здесь производительность μ изменяется, чтобы иметь лучшее представление о колебаниях производительности системы по сравнению с различными значениями производительности μ . Различные показатели производительности в зависимости от μ представлены в виде графика на рис. 8 8d.


    Рисунок 8
    Показатели производительности системы в зависимости от μ .

    На рис. 8а представлена ​​тенденция увеличения количества полуфабрикатов по сравнению с увеличением μ. Действительно, увеличение μ означает большее количество произведенных продуктов, и эта проблема приводит к большему поступлению полуфабрикатов в буфер OPP.Это более высокое заполнение буфера проявляется в большем количестве полуфабрикатов в устойчивом состоянии. Ожидаемое количество невыполненных заказов имеет тенденцию к снижению по сравнению с увеличением μ, что показано на рисунке 8b. Эта тенденция к снижению может быть объяснена той же логикой тренда полуфабрикатов. Когда у нас выше вход продуктов в буфер, количество прибывших клиентов, которые сталкиваются с пустым буфером, уменьшается. Таким образом, уменьшение ожидаемых невыполненных заказов является логичным результатом по сравнению с более высокими значениями μ.

    Изменения ожидаемого времени выполнения заказов и скорости потери клиентов показаны на рисунках 8 8d. При увеличении производительности заказы клиентов выполняются быстрее, а длина очереди сокращается, что приводит к сокращению времени ожидания и выполнения заказа. Длина очереди напрямую используется в формулах расчета коэффициента потери клиентов. В результате, снижение скорости потери клиентов по сравнению с увеличением μ является разумной тенденцией.

    5.3. Влияние разного количества строк настройки T на показатели производительности системы

    Поскольку скорость производства и скорость поступления клиентов влияют на производительность системы, количество производственных линий после OPP также может влиять на производительность системы, изменяя важные характеристики системы.Изменения показателей производительности системы в зависимости от количества линий настройки продукта показаны на рисунках 9-9d.


    Рисунок 9
    Показатели производительности системы в зависимости от T .

    Анализ показателей производительности системы по сравнению с T аналогичен анализу системы по сравнению с μ-флуктуациями, поскольку наиболее важным эффектом увеличения T является более высокая скорость персонализации продукта. Благодаря этим дополнительным линиям настройки полуфабрикаты изготавливаются быстрее, и меньшее количество полуфабрикатов будет доступно в буфере.Поскольку уровень полуфабрикатов в буфере уменьшается, логично, что больше клиентов будут сталкиваться с пустым буфером, поэтому количество невыполненных заказов увеличивается в устойчивом состоянии.

    Такое поведение системы при увеличении T показано на рисунках 9-9b. Кроме того, очевидно, что при большем количестве строк настройки заказы клиентов удовлетворяются быстрее. Эта более высокая скорость приводит к сокращению очереди клиентов и снижению уровня потери клиентов в устойчивом состоянии. Эти факты показаны на рисунках 9-9d.

    6. Выводы

    В этой статье разработана модель, показывающая применение производства на складе (MTS)/производства на заказ (MTO) в производственной линии, чтобы получить преимущества стратегий MTS и MTO. Модель способна находить точку проникновения заказа (OPP) в производственной линии, которая является буфером полуфабрикатов в производственной системе. Как и во многих реальных производственных системах, производственные процессы и поступления клиентов носят стохастический характер, и клиенты могут не войти в систему из-за длинной очереди или покинуть систему из-за длительного времени ожидания.

    Разработана двумерная модель организации очередей для получения показателей производительности в двух разных сценариях. Основное различие между двумя сценариями заключается в использовании станций настройки, где система может только настраивать полуфабрикаты на основе конкретных заказов клиентов или настраивать полуфабрикаты на основе как заказов клиентов, так и прогноза. Целевая функция является стоимостной и позволяет руководителю производственной линии найти оптимальное место ОПП, оптимальное количество линий настройки после ОПП и наилучший сценарий настройки полуфабрикатов.

    Применимость представленной модели и сценариев показана на числовом примере, а наблюдения показывают выпуклость общей стоимости с точки зрения процента завершения продукта и количества строк настройки после OPP. Кроме того, показано, что увеличение производительности приводит к более высокому ожидаемому количеству полуфабрикатов в буфере, меньшему ожидаемому количеству невыполненных заказов, меньшему ожидаемому времени выполнения заказа и меньшему уровню потери клиентов. Наблюдение за поведением системы за счет увеличения количества строк настройки после OPP показывает снижение ожидаемого количества полуфабрикатов в буфере, увеличение ожидаемого количества невыполненных заказов, сокращение ожидаемого времени выполнения заказа и коэффициент потери клиентов.

    В текущем исследовании рассматривается экспоненциальное время между прибытием клиентов и получением полуфабрикатов. В качестве возможности будущих исследований можно рассмотреть другие применимые распределения для моделирования этой проблемы. Применение теории нечеткости — еще один интересный способ изучения неопределенного поведения клиентов и производственной линии в изучаемой системе. Кроме того, в будущих исследованиях можно изучить влияние некоторых других характеристик рынка, таких как конкурирующие компании или продукты-заменители, на OPP или требуемую производительность.

    Ссылки

    Альмедаве, Э., и Джукс, Э. (2013). Анализ производительности и оптимизация гибридных производственных систем в рамках политики пакетного заказа. Международный журнал экономики производства, 144(1), 200-208. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpe.2013.02.005.

    Бхат, ООН (2008). Введение в теорию массового обслуживания: моделирование и анализ в приложениях. Бостон: Биркхаузер. http://dx.doi.org/10.1007/978-0-8176-4725-4.

    Донат, Б. (2002).Справочник IOMA по логистике и управлению запасами. США: Джон Вили и сыновья.

    Галеххондаби И., Сормаз Д. и Векман Г. (2016). Множественные точки развязки заказов клиентов в гибридной производственной цепочке MTS/MTO с неопределенностью спроса в двух последовательных эшелонах. OPSEARCH, 53(4), 976-997. http://dx.doi.org/10.1007/s12597-016-0265-6.

    Херер, Ю. Т., Цур, М., и Юкесан, Э. (2002). Перевалка: новое средство инвентаризации для обеспечения гибкости цепочки поставок.Международный журнал экономики производства, 80(3), 201-212. http://dx.doi.org/10.1016/S0925-5273(02)00254-2.

    Хукстра, С., и Ромме, Дж. (1992). Интегральные логистические структуры: формирование клиентоориентированного товаропотока. Лондон: Макгроу-Хилл.

    Джьюкс, Э.М., и Альфа, А.С. (2009). Модель очереди отсроченной дифференциации продукта. Европейский журнал оперативных исследований, 199(3), 734-743. http://dx.doi.org/10.1016/j.ejor.2008.08.001.

    Калантари, М., Раббани, М., и Эбадиан, М. (2011). Система поддержки принятия/отклонения заказов в гибридных производственных системах МТС/МТО. Прикладное математическое моделирование, 35 (3), 1363-1377. http://dx.doi.org/10.1016/j.apm.2010.09.015.

    Лю, В., Ян, Ю., Сюй, Х., Лю, X., Ван, Ю., и Лян, З. (2014). Модель планирования времени цепочки поставок логистических услуг, основанная на точке разделения заказа клиента: перспектива с точки зрения постоянного времени работы услуги. Журнал «Научный мир», 2014, 1-22.PM: 24715818.

    Neuts, MF (1981). Матрично-геометрические решения в стохастических моделях: алгоритмический подход. Балтимор: Издательство Университета Джона Хопкинса.

    Олхагер, Дж., и Праджого, Д.И. (2012). Влияние инициатив по улучшению производства и цепочки поставок: обзор, сравнивающий фирмы, производящие продукцию на заказ и продукцию на складе. Омега, 40(2), 159-165. http://dx.doi.org/10.1016/j.omega.2011.05.001.

    Олхагер, Дж. (2003). Стратегическое позиционирование точки проникновения заказа.Международный журнал экономики производства, 85 (3), 319-329. http://dx.doi.org/10.1016/S0925-5273(03)00119-1.

    Рафии, Х., и Раббани, М. (2011). Разделение заказа и определение точки проникновения заказа в гибридном контексте производства на складе/производстве на заказ. Компьютеры и промышленная инженерия, 61 (3), 550-560. http://dx.doi.org/10.1016/j.cie.2011.04.010.

    Шарда, Б., и Акия, Н. (2012). Выбор политик изготовления на склад и отсрочки для различных продуктов на химическом заводе: тематическое исследование с использованием моделирования дискретных событий.Международный журнал экономики производства, 136 (1), 161-171. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpe.2011.10.001.

    Шарман, Г. (1984). Новое открытие логистики. Harvard Business Review, 62(5), 71-80.

    Шидпур, Х., Да Кунья, К., и Бернард, А. (2014). Анализ позиционирования точки разделения заказов одного и нескольких клиентов на основе ценности клиента: многоцелевой подход. Труды CIRP, 17, 669-674. http://dx.doi.org/10.1016/j.procir.2014.01.102.

    Соман, К.А., ван Донк, Д. П., и Галман, Г. (2004). Комбинированное производство на заказ и производство на складе в системе производства продуктов питания. Международный журнал экономики производства, 90(2), 223-235. http://dx.doi.org/10.1016/S0925-5273(02)00376-6.

    Сюер, Г. А., и Лобо, Р. (2011). Сравнение подключенных и отключенных сотовых систем: тематическое исследование. В В. Модрак, Р. Судхакара Пандиан (ред.), Исследования в области управления операциями и сотовых производственных систем: инновационные методы и подходы. Херши: IGI Global.

    Sun, XY, Ji, P., Sun, LY, & Wang, YL (2008). Размещение нескольких точек развязки в сети питания. Международный журнал экономики производства, 113(2), 943-956. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpe.2007.11.012.

    Теймури, Э., Модаррес, М., Хондаби, И.Г., и Фатхи, М. (2012). Очередь подход для принятия решений о точке проникновения заказа в многозвенных цепях поставок. Международный журнал передовых производственных технологий, 63 (1-4), 359-371.http://dx.doi.org/10.1007/s00170-012-3913-x.

    Ван, Дж. Л. (2009). Применение теории нечетких множеств в цепочке поставок к моделям управления запасами — анализ системы DRP. Экспертные системы с приложениями, 36(5), 9229-9239. http://dx.doi.org/10.1016/j.eswa.2008.12.047.

    Ву, Д., и Олсон, Д.Л. (2008). Риск цепочки поставок, моделирование и выбор поставщика. Международный журнал экономики производства, 114 (2), 646-655. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpe.2008.02.013.

    Ву, М.C., Цзян, Дж. Х., и Чанг, В. Дж. (2008). Планирование гибридной полупроводниковой фабрики MTO/MTS с функциями машинного назначения. Международный журнал экономики производства, 112(1), 416-426. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpe.2007.04.008.

    Чжан З.Г., Ким И., Спрингер М., Цай Г. и Ю Ю. (2013). Динамическое объединение операций производства на склад и на заказ. Международный журнал экономики производства, 144(1), 44-56. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpe.2013.01.012.

    Приложение А

    Матричный геометрический метод открыть формулу.

    Bn = [BN0,0 BN0,1 BN1,1 BN1,2 ⋱ ⋱ BN S-1, S-1 BN S-1, S Bn S, S] (A.1)

    Bn k, k = {- (μθ + pnλ) 0≤k≤s-1-pnλ k = sbn k, k + 1 = μθ 0≤k≤s-1} n = 0 (a.2)

    Bn k, k = {- (μθ + pnλ + nβ) k = 0- (μθ + pnλ + nβ + tμαα (1-θ) + μ (m — g)) 1≤k≤s-1- (pnλ + Nβ + Tμαα (1-θ) + μ (M-G)) k = sbn k, k + 1 = μθ 0≤k≤s-1} 1≤n≤n-1 (a.3)

    Bn k, k = {- (μθ + nβ) k = 0- (μθ + nβ + tμαα (1-θ) + μ (m — g)) 1≤k≤s-1- (nβ + tμαα (1- θ) + μ (M-G)) k = sbn k, k + 1 = μθ 0≤k≤s-1} n = n (A.4)

    An=PnλIk×k,      0≤n≤N−1(A.5)

    Cn = [Nβ Tμαα (1-θ) + μ (M-G) Nβ ⋱ ⋱ Tμαα (1-θ) + μ (M-G) Nβ Tμαα (1-θ) + μ (M-G) Nβ], 1≤n≤N(А.6)

    Примечания

    Как цитировать эту статью: Галеххондаби, И., и Суер, Г. (2018). Анализ производительности производственной линии в рамках производства MTS/MTO: подход теории массового обслуживания. Производство, 28, е20180024. https://doi.org/10.1590/0103-6513.20180024.

    Примечания автора

    *[email protected]

    Решено: нет звука в файлах .MTS — сообщество поддержки Adobe

    Здравствуйте, пользователи Premier Pro. Я нашел простое исправление для файлов MTS, которые внезапно теряют звук.Вчера я провел три часа по телефону со службой поддержки Adobe, и человек не смог найти решение. Он рекомендует мне создать «папку просмотра» и установить формат Quicktime и H.264. Затем импортируйте затронутые клипы в проект, в котором отсутствует звук. На самом деле я никогда не пробовал, потому что нашел гораздо более простой способ справиться с этой надоедливой проблемой. Пожалуйста, смотрите ниже.

    Что мне показалось чрезвычайно интересным, так это то, что исходный импорт с видеокарты содержал звук, но импортированные клипы каким-то образом теряли звук.Это не имело никакого смысла. Вот успешный путь, который я обнаружил:  Прежде чем выполнять описанные ниже действия, очистите кэш мультимедиа.

    1) Скопировать из оригинального импорта с видеокарты затронутые ролики, т.е. те, которые потеряли звук. Скопируйте клип MTS и соответствующий файл XMP

    2) Вставьте их в папку, отличную от папки, которая использовалась для исходного импорта клипов до потери звука. Я назвал эту новую папку «Изменил МТС». В моей последовательности было 24 клипа без звука, которые я скопировал.

    3) Вернитесь в Premier Pro, откройте соответствующую последовательность, выберите клипы в папке проекта, которые потеряли звук, а затем выберите «Связать медиа». Секрет в том, чтобы связать задействованные клипы с новыми созданными вами копиями каждого клипа, т. е. я выбрал клипы, которые я вставил в папку «Измененный МТС.

    Угадайте, что? Сработало отлично. Эти клипы восстановили потерянный звук. Будьте осведомлены….дайте им время, чтобы согласовать. Premier Pro рассматривает ссылку как новое медиа, которое необходимо согласовать.Не прерывайте этот процесс.

    Вот что я думаю о том, что происходит, когда файлы MTS внезапно теряют звук. Исходный импортированный клип становится поврежденным по неизвестной причине. Даже если вы свяжете этот поврежденный клип с исходным клипом с видеокарты, он не будет работать. Вы должны скопировать затронутые исходные клипы и поместить их в новую папку, а затем связать их. Я считаю, что это удалось, потому что Premier рассматривает их как новый клип и поэтому проходит процесс согласования.

    Очень простое решение проблемы, которую я часами пытался найти в службе поддержки Adobe, но безрезультатно. Если вы внезапно потеряли звук в своей последовательности, включающей клипы MTS, просто скопируйте поврежденные исходные клипы с видеокарты и поместите их в новую папку. Не забудьте включить файл XMP. Свяжите клипы в Premier Pro со скопированными клипами и дождитесь завершения процесса согласования.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.