Miwi: MiWi™ Protocol | Microchip Technology — ПКРЕГИОН компьютерный магазин в Екатеринбурге недорогой техники каталог и цены с доставкой

Содержание

Среда MiWi DE содержит стеки протоколы MiWi P2P, MiWi и MiWi PRO

Компания Microchip объявила о расширении своей среды разработки MiWi Development Environment, которая предоставляет законченную экосистему для разработки беспроводных сетей. Среда MiWi DE содержит бесплатные стеки протоколы MiWi P2P, MiWi и MiWi PRO для построения беспроводных сетей топологий «звезда» и «сеть», отладочный комплект на 8-битных контроллерах Wireless Development Kit (WDK), анализатор сетей ZENA с поддержкой диапазонов частот 2,4 ГГц, 868 и 915 МГц, а также кроссплатформенную среду Wireless Development Studio (WDS) с поддержкой операционных систем Linux, Mac OS и Windows. Среда MiWi DE позволяет осуществлять разработку беспроводных сетей ISM-диапазона для приборов домашней автоматизации, промышленных применений, беспроводных датчиков и приборов учета ресурсов.

В качестве единой среды разработки для трех протоколов и трех взаимозаменяемых отладочных радиоплат новая переработанная платформа предоставляет гибкий и недорогой инструмент, который помогает разработчикам снизить риски и уменьшить время выхода на рынок микропотребляющих радиочастотных и интеллектуальных устройств.

Новый сетевой протокол MiWi PRO оптимально подходит для разработки средних и больших радиосетей. Он поддерживает маршрутизацию через 64 промежуточных узла и общее количество узлов в сети до 8000. Программное обеспечение Wireless Development Studio с помощью графического интерфейса позволяет быстро разработать и настроить беспроводную сеть, а аппаратный сниффер ZENA — осуществлять контроль, собирать данные и отлаживать работу сети.

Беспроводной адаптер ZENA — это компактный, многофункциональный, подключаемый к Wireless Development Studio инструмент, который можно использовать для прослушивания, тестирования сети или конфигурировать как отдельный узел сети.
Беспроводной комплект разработки “8-bit Wireless Development Kit” дает возможность применять микропотребляющие XLP (eXtreme Low Power) микроконтроллеры PIC в разработке сети, протестировать и освоить работу беспроводной сети. Комплект содержит пару беспроводных дочерних плат PICtail и две батарейные микроконтроллерные платы. В него также можно добавлять дополнительные узлы для построения большой радиосети.

AC164137-2 — Microchip — Дочерняя плата, MRF49XА, РЧ TXRX

Дочерняя плата, MRF49XА, РЧ TXRX, PICC18, поддержка программного стека MiWi и драйвера Radio Utility

Обзор продукта

The AC164137-2 is a MRF49XA PICtail Plus daughter board (868/915MHz). The MRF49XA PICtail/PICtail Plus daughter board is a complete sub-GHz wireless transceiver. This is a demonstration and development daughter board for the MRF49XA ISM Band Sub-GHz RF Transceiver. The MRF49XA supports FSK modulation with FHSS capability is ideal for two-way, short-range wireless applications. The daughter board can plug into multiple Microchip Technology demonstration and development boards. For example, for 8bit microcontroller development using the PIC18 explorer board (DM183032) or 16bit microcontroller development using the explorer 16 development board (DM240001). A simple demonstration program has been written for the PIC18 explorer board. Supported MiWi software stack and radio utility driver can be downloaded from the Microchip website.

Fully integrated with Sub-GHz transceiver
CMOS
TTL compatible
Integrated 10MHz oscillator circuitry
FSK with FHSS capability
Integrated power amplifier
Power saving sleep modes
16bit Rx data registers
Two 8bit Tx data registers

Области применения

Беспроводное, Связь и Сеть, Радиочастотная Связь

Предупреждения

Ensure that the development/demonstration board that the daughter board is plugged into meets this voltage requirement; otherwise, damage to the MRF49XA may occur.

Информация об изделиях

Техническая документация (2)

???PF_PDP_COMPARE_MAX_ITEMS_MESG???

Электроснегоход-вездеход-квадроцикл MIWI ML-60 (800W/36V/12ah) 3в1

Первый детский снегоход-вездеход на электротяге!

Представляем Вашему вниманию новинку на рынке детской мототехники — детский электрический снегоход/вездеход.Спортивный, современный дизайн. Очень прост в управлении и обслуживании. Этот вездеход максимально надёжен и устойчив к механическим повреждениям.Электро снегоход весьма безопасен и удобен: широкие подножки, эргономичное, удобное сиденье, амортизаторы. Установлены подкрылки, которые защищают ноги ребёнка. Дисковые тормоза обеспечивают моментальную остановку в любой ситуации. Заводится даже при самых низких температурах.Не упустите такой шанс подарить ребенку современный подарок!Предназначен для детей от 3 лет.Данная модель представлена в трёх цветах:черный,синий,красный.За счет компактных размеров вездеход доступен для перевозки в багажнике. Иными словами, выезжая в путешествие, вы всегда сможете взять его с собой.

За удобство эксплуатации и безопасность отвечают:

амортизаторы;
подкрылки, защищающие ноги ребенка;

широкие подножки;
сидушка, отличающаяся эргономичностью и удобством;
дисковые тормоза, обеспечивающие быструю установку электро снегохода.
три скорости езды
мощный мотор
Передний и задний ход.

Характеристики:

Электродвигатель: 36 Вольта 800 Ватт с редуктором
Материал: стальная труба и пластик
Аккумулятор: 3х12V/12AH
Время работы: 2-3 часа
Три скорости ( на ручке переключатель есть)
Максимальная скорость: 10-20-30 км/ч.
Запас хода: до 20-25 км.
Мощные передние фары (на ручке есть вкл.выкл)
Тормоз: ручной задний дисковый
Дисплей с индикацией заряда аккумулятора
Замок зажигания
Максимальная нагрузка: 70 кг.

Цвет: уточните у менеджера большой ассортимент
Кузов: стальная рама
Система запуска: электро
Подвеска передняя: амортизаторы
Подвеска задняя: амортизатор
Дорожный просвет: 30 мм.
Ширина гусениц: 150 мм.

Габариты и вес:

Вес в собранном виде: 35 кг.
Вес в коробке: 40 кг.
Размер в собранном виде:152x50x62 см.
Размер упаковки: 104x58x62 см.

Комплект поставки:

Электроснегоход ML-60
Зарядное устройство
Инструкция пользователя
4шт колеса
2 шт гусеницы
2 лыжи

MIWI Харьков Цена оптом и в розницу ✓ Стройбаза КУБ

Популярные разделы в нашем интернет-магазине

✓ Цена ✓ наличие ✓ доставка в Харькове

Рассчитать необходимое количество товаров для Вашего проекта поможет строительный калькулятор на нашем сайте. Для этого Вам всего лишь нужно внести параметры помещения, в котором будут проводиться работы и за считанные секунды калькулятор выдаст список необходимого количества материалов. Купить продукцию MIWI в Харькове можно в один клик с помощью функции быстрого заказа, содержащей в себе минимальное количество полей для заполнения, что позволяет сэкономить Ваше время. Интернет-магазин КУБ реализует материалы производителя MIWI на территории города Харьков и Харьковской области, в том числе, в таких населенных пунктах как: Великобурлуцкий район, Дергачевский район, Коломакский район, Краснокутский район, Купянский район, Нововодолажский район, Печенежский район.

MIWI — гарантия качества и стабильности производства

В линейке товаров компании MIWI представлены товары разных ценовых категорий, что позволяет приобретать ее потребителю с любым уровнем дохода в Харькове. Качество от этого не меняется, так как продукция изготавливается на европейском оборудовании с использованием высококачественного сырья из недр Харьковской области.

Широкий ассортимент и всегда наличие на складах по Харькову

MIWI в Харькове охватывает весь спектр потребительского спроса на строительную продукцию, учитывает потребности различных категорий покупателей. Главные приоритеты, к которым стремится компания MIWI:

— эффективная и ответственная работа в тандеме с ростом продаж;
— конкурентная по качеству и цене продукция, как залог крепких партнерских отношений с дилерами Харьковской области;
— инновационные решения на рынке строительных материалов;
— автоматизированный контроль качества каждого процесса;
— экологичность продукции и безопасность производства для окружающей среды как философия компании MIWI.

Характеристики, инструкция, видео-обзоры

В случае возникновения вопросов в процессе приобретения товаров производителя MIWI, наши менеджеры готовы предоставить качественную консультацию и помочь с выбором и расчетом необходимого количества стройматериалов в Харькове. В описании каждой товарной позиции в нашем интернет-магазине представлены все характеристики и подробная инструкция по применению, поэтому продукцию торговой марки MIWI могут использовать не только профессиональные строители, но и люди без опыта в строительстве.

📌 Как выбрать нужный товар от производителя MIWI ?

Благодаря гибкой фильтрации по размерам, области применения и фасовке, Вы сможете найти необходимый товар под Ваши потребности и бюджет.

❤️ Какие материалы от производителя «MIWI» самые популярные в 2021 году?

💰 Какие самые дешевые материалы от производителя «MIWI»?

🚚 Сколько стоит доставка в Харькове?

Стоимость доставки материалов по Харькову и Харьковской области зависит от расстояния от склада загрузки до адреса выгрузки, а также общего веса и объема заказа. Звоните, и консультант просчитает точную стоимость и сроки.

отзывы, фото и характеристики на Aredi.ru

Мы доставляем посылки в г. Калининград и отправляем по всей России

1
Товар доставляется от продавца до нашего склада в Польше. Трекинг-номер не предоставляется.
2
После того как товар пришел к нам на склад, мы организовываем доставку в г. Калининград.
3
Заказ отправляется курьерской службой EMS или Почтой России. Уведомление с трек-номером вы получите по смс и на электронный адрес.

Ориентировочную стоимость доставки по России менеджер выставит после оформления заказа.

Гарантии и возврат

Гарантии
Мы работаем по договору оферты, который является юридической гарантией того, что мы выполним свои обязательства.

Возврат товара
Если товар не подошел вам, или не соответсвует описанию, вы можете вернуть его, оплатив стоимость обратной пересылки.

У вас остаются все квитанции об оплате, которые являются подтверждением заключения сделки.
Мы выкупаем товар только с проверенных сайтов и у проверенных продавцов, которые полностью отвечают за доставку товара.
Мы даем реальные трекинг-номера пересылки товара по России и предоставляем все необходимые документы по запросу.
5 лет успешной работы и тысячи довольных клиентов.

Поставщики и ресурсы беспроводной связи RF

О компании RF Wireless World

Веб-сайт RF Wireless World является домом для поставщиков и ресурсов радиочастотной и беспроводной связи. На сайте представлены статьи, руководства, поставщики, терминология, исходный код (VHDL, Verilog, MATLAB, Labview), тестирование и измерения, калькуляторы, новости, книги, загрузки и многое другое.

Сайт RF Wireless World охватывает ресурсы по различным темам, таким как RF, беспроводная связь, vsat, спутник, радар, волоконная оптика, микроволновая печь, wimax, wlan, zigbee, LTE, 5G NR, GSM, GPRS, GPS, WCDMA, UMTS, TDSCDMA, Bluetooth, Lightwave RF, z-wave, Интернет вещей (IoT), M2M, Ethernet и т. Д.Эти ресурсы основаны на стандартах IEEE и 3GPP. В нем также есть академический раздел, который охватывает колледжи и университеты по инженерным дисциплинам и MBA.

Статьи о системах на основе Интернета вещей

Система обнаружения падений для пожилых людей на основе Интернета вещей : В статье рассматривается архитектура системы обнаружения падений, используемой для пожилых людей. В нем упоминаются преимущества или преимущества системы обнаружения падений Интернета вещей. Читать дальше➤
Также обратитесь к другим статьям о системах на основе Интернета вещей следующим образом:
• Система очистки туалетов самолета. • Система измерения столкновений • Система отслеживания скоропортящихся продуктов и овощей • Система помощи водителю • Система умной торговли • Система мониторинга качества воды. • Система Smart Grid • Система умного освещения на базе Zigbee • Умная система парковки на базе Zigbee • Система умной парковки на основе LoRaWAN

RF Статьи о беспроводной связи

В этом разделе статей представлены статьи о физическом уровне (PHY), уровне MAC, стеке протоколов и сетевой архитектуре на основе WLAN, WiMAX, zigbee, GSM, GPRS, TD-SCDMA, LTE, 5G NR, VSAT, Gigabit Ethernet на основе IEEE / 3GPP и т. Д. .стандарты. Он также охватывает статьи, относящиеся к испытаниям и измерениям, по тестированию на соответствие, используемым для испытаний устройств на соответствие RF / PHY. СПРАВОЧНЫЕ СТАТЬИ УКАЗАТЕЛЬ >>.

Физический уровень 5G NR : Обработка физического уровня для канала 5G NR PDSCH и канала 5G NR PUSCH рассмотрена поэтапно. Это описание физического уровня 5G соответствует спецификациям физического уровня 3GPP. Читать дальше➤

Основы повторителей и типы повторителей : В нем объясняются функции различных типов ретрансляторов, используемых в беспроводных технологиях.Читать дальше➤

Основы и типы замирания : В этой статье рассматриваются мелкомасштабные замирания, крупномасштабные замирания, медленные, быстрые и т. Д., Используемые в беспроводной связи. Читать дальше➤

Архитектура сотового телефона 5G : В этой статье рассматривается блок-схема сотового телефона 5G с внутренними модулями 5G. Архитектура сотового телефона. Читать дальше➤

Основы помех и типы помех: В этой статье рассматриваются помехи в соседнем канале, помехи в совмещенном канале, Электромагнитные помехи, ICI, ISI, световые помехи, звуковые помехи и т. Д.Читать дальше➤

5G NR Раздел

В этом разделе рассматриваются функции 5G NR (New Radio), нумерология, диапазоны, архитектура, развертывание, стек протоколов (PHY, MAC, RLC, PDCP, RRC) и т. Д. 5G NR Краткий указатель ссылок >>
• Мини-слот 5G NR • Часть полосы пропускания 5G NR • 5G NR CORESET • Форматы DCI 5G NR • 5G NR UCI • Форматы слотов 5G NR • IE 5G NR RRC • 5G NR SSB, SS, PBCH • 5G NR PRACH • 5G NR PDCCH • 5G NR PUCCH • Эталонные сигналы 5G NR • 5G NR m-последовательность • Золотая последовательность 5G NR • 5G NR Zadoff Chu Sequence • Физический уровень 5G NR • Уровень MAC 5G NR • Уровень 5G NR RLC • Уровень 5G NR PDCP

Учебные пособия по беспроводным технологиям

В этом разделе рассматриваются обучающие материалы по радиочастотам и беспроводной связи.Он охватывает учебники по таким темам, как сотовая связь, WLAN (11ac, 11ad), wimax, bluetooth, zigbee, zwave, LTE, DSP, GSM, GPRS, GPS, UMTS, CDMA, UWB, RFID, радар, VSAT, спутник, WLAN, волновод, антенна, фемтосота, тестирование и измерения, IoT и т. Д. См. УКАЗАТЕЛЬ >>

Учебное пособие по 5G — В этом учебном пособии по 5G также рассматриваются следующие подтемы по технологии 5G:
Учебное пособие по основам 5G. Частотные диапазоны Учебник по миллиметровым волнам Волновая рама 5G мм Зондирование волнового канала 5G мм 4G против 5G Испытательное оборудование 5G Сетевая архитектура 5G Сетевые интерфейсы 5G NR канальное зондирование Типы каналов 5G FDD против TDD Разделение сети 5G NR Что такое 5G NR Режимы развертывания 5G NR Что такое 5G TF

В этом учебном пособии GSM рассматриваются основы GSM, сетевая архитектура, сетевые элементы, системные спецификации, приложения, Типы пакетов GSM, структура или иерархия кадров GSM, логические каналы, физические каналы, Физический уровень GSM или обработка речи, вход в сеть мобильного телефона GSM, установка вызова или процедура включения питания, MO-вызов, MT-вызов, VAMOS, AMR, MSK, модуляция GMSK, физический уровень, стек протоколов, основы работы с мобильным телефоном, Планирование RF, нисходящая линия связи PS и восходящая линия связи PS.
➤Подробнее.

LTE Tutorial , охватывающий архитектуру системы LTE, охватывающий основы LTE EUTRAN и LTE Evolved Packet Core (EPC). Он обеспечивает связь с обзором системы LTE, радиоинтерфейсом LTE, терминологией LTE, категориями LTE UE, структурой кадра LTE, физическим уровнем LTE, Стек протоколов LTE, каналы LTE (логические, транспортные, физические), пропускная способность LTE, агрегация несущих LTE, передача голоса по LTE, расширенный LTE, Поставщики LTE и LTE vs LTE продвинутые.➤Подробнее.

RF Technology Stuff

Эта страница мира беспроводной радиосвязи описывает пошаговое проектирование преобразователя частоты RF на примере преобразователя RF UP от 70 МГц до диапазона C. для микрополосковой платы с использованием дискретных радиочастотных компонентов, а именно. Смесители, гетеродин, MMIC, синтезатор, опорный генератор OCXO, колодки аттенюатора. ➤Подробнее.
➤Проектирование и разработка радиочастотного трансивера ➤Конструкция RF-фильтра ➤Система VSAT ➤Типы и основы микрополосковой печати ➤ОсновыWaveguide

Секция испытаний и измерений

В этом разделе рассматриваются контрольно-измерительные ресурсы, испытательное и измерительное оборудование для тестирования ИУ на основе Стандарты WLAN, WiMAX, Zigbee, Bluetooth, GSM, UMTS, LTE.УКАЗАТЕЛЬ испытаний и измерений >>
➤Система PXI для T&M. ➤ Генерация и анализ сигналов ➤Измерения слоя PHY ➤Тест на соответствие устройства WiMAX ➤ Тест на соответствие Zigbee ➤ Тест на соответствие LTE UE ➤Тест на соответствие TD-SCDMA

Волоконно-оптическая технология

Оптоволоконный компонент , основы, включая детектор, оптический соединитель, изолятор, циркулятор, переключатели, усилитель, фильтр, эквалайзер, мультиплексор, разъемы, демультиплексор и т. д.Эти компоненты используются в оптоволоконной связи. Оптические компоненты INDEX >>
➤Учебник по оптоволоконной связи ➤APS в SDH ➤SONET основы ➤SDH Каркасная конструкция ➤SONET против SDH

Поставщики и производители беспроводных радиочастотных устройств

Сайт RF Wireless World охватывает производителей и поставщиков различных радиочастотных компонентов, систем и подсистем для ярких приложений, см. ИНДЕКС поставщиков >>.

Поставщики радиочастотных компонентов, включая радиочастотный изолятор, радиочастотный циркулятор, радиочастотный смеситель, радиочастотный усилитель, радиочастотный адаптер, радиочастотный разъем, радиочастотный модулятор, радиочастотный трансивер, PLL, VCO, синтезатор, антенну, генератор, делитель мощности, сумматор мощности, фильтр, аттенюатор, диплексор, дуплексер, микросхема резистора, микросхема конденсатора, индуктор микросхемы, ответвитель, оборудование ЭМС, программное обеспечение для проектирования радиочастот, диэлектрический материал, диод и т.Производители радиокомпонентов >>
➤Базовая станция LTE ➤RF Циркулятор ➤RF Изолятор ➤Кристаллический осциллятор

MATLAB, Labview, встроенные исходные коды

Раздел исходного кода RF Wireless World охватывает коды, связанные с языками программирования MATLAB, VHDL, VERILOG и LABVIEW. Эти коды полезны для новичков в этих языках. ИНДЕКС ИСХОДНОГО КОДА >>
➤3-8 декодер кода VHDL ➤Код MATLAB для дескремблера ➤32-битный код ALU Verilog ➤T, D, JK, SR триггеры labview коды

* Общая информация о здоровье населения *

Выполните эти пять простых действий, чтобы остановить коронавирус (COVID-19).
СДЕЛАЙТЕ ПЯТЬ
1. РУКИ: часто мойте их.
2. КОЛЕНО: Откашляйтесь.
3. ЛИЦО: не трогайте его
4. НОГИ: держитесь на расстоянии более 3 футов (1 м) друг от друга.
5. ЧУВСТВОВАТЬ: Болен? Оставайся дома

Используйте технологию отслеживания контактов >>, соблюдайте >> рекомендации по социальному дистанцированию и установить систему видеонаблюдения >> чтобы спасти сотни жизней. Использование концепции телемедицины стало очень популярным в таким странам, как США и Китай, чтобы остановить распространение COVID-19, поскольку это заразное заболевание.

RF Калькуляторы и преобразователи беспроводной связи

Раздел «Калькуляторы и преобразователи» охватывает ВЧ-калькуляторы, беспроводные калькуляторы, а также преобразователи единиц измерения. Сюда входят такие беспроводные технологии, как GSM, UMTS, LTE, 5G NR и т. Д. СПРАВОЧНЫЕ КАЛЬКУЛЯТОРЫ Указатель >>.
➤ Калькулятор пропускной способности 5G NR ➤5G NR ARFCN против преобразования частоты ➤Калькулятор скорости передачи данных LoRa ➤LTE EARFCN для преобразования частоты ➤ Калькулятор антенн Яги ➤ Калькулятор времени выборки 5G NR

IoT-Интернет вещей Беспроводные технологии

Раздел IoT охватывает беспроводные технологии Интернета вещей, такие как WLAN, WiMAX, Zigbee, Z-wave, UMTS, LTE, GSM, GPRS, THREAD, EnOcean, LoRa, SIGFOX, WHDI, Ethernet, 6LoWPAN, RF4CE, Bluetooth, Bluetooth Low Power (BLE), NFC, RFID, INSTEON, X10, KNX, ANT +, Wavenis, Dash7, HomePlug и другие.Он также охватывает датчики Интернета вещей, компоненты Интернета вещей и компании Интернета вещей.
См. Главную страницу IoT >> и следующие ссылки.
➤ НИТЬ ➤EnOcean ➤Учебник по LoRa ➤Учебник по SIGFOX ➤WHDI ➤6LoWPAN ➤Zigbee RF4CE ➤NFC ➤Lonworks ➤CEBus ➤UPB

СВЯЗАННЫЕ ЗАПИСИ

RF Wireless Учебники

Различные типы датчиков

Поделиться страницей

Перевести страницу

Piwi, Hiwi, Miwi: важные гены для эффективного спермиогенеза

мутации зародышевой линии в гене Piwi и его аналогах у человека и мыши ( Hiwi и Miwi соответственно) непосредственно ответственны за азооспермию, согласно данным бесплодных мужчин и моделей мышей, опубликованным в Cell .

Предоставлено: Thinkstock / cre8tive_studios

В большинстве клеток ДНК упакована в октамер гистонов; однако в сперме ДНК упакована на протамины, что обеспечивает большую степень конденсации ДНК, чтобы заключить ДНК в крошечную головку сперматозоида. Обмен гистона на протамин сложен и, как полагают, включает глобальное убиквитинирование h3A и h3B, специфически запускаемое на стадии спермиогенеза сперматогенеза.

Белки Piwi необходимы для сперматогенеза у разных видов, включая РНК, специфичные для зародышевой линии, взаимодействующие с Piwi (piRNA) и защищающие целостность генома в зародышевых клетках.Четыре гомолога человека Hiwi , Hili , Hiwi2 и Piwil3 экспрессируются в семенниках человека, но их функции до сих пор остаются неизвестными.

Gou и его коллеги предположили, что мутации в консервативном деструктивном боксе (D-боксе) N-концевого домена HIWI могут играть роль в бесплодии человека. Они начали свои исследования со скрининга мутаций в элементе D-бокса Hiwi у 413 пациентов с идиопатической азооспермией и 300 фертильных контрольных мужчин путем секвенирования области D-бокса.Гетерозиготные мутации были идентифицированы у трех мужчин с азооспермией (R218A / L221A (Пациент 1), L221G / N225H (Пациент 2) и L221R (Пациент 3)), все из которых нарушали убиквитинирование Hiwi .

Чтобы лучше понять роль этих генов в азооспермии, Gou et al . создали условную модель мыши с нокаутом, основанную на мутациях, идентифицированных у пациента 1, с мутациями R218A / L221A у мыши Miwi . Скрещивание этих мышей с трансгенной мышью TNAP-Cre, специфичной для первичных зародышевых клеток (PGC), привело к получению гетерозиготных мышей с нокаутом R218A / L221A, специфичных для зародышевой линии ( Miwi ^{+ / DB} -Cre).Все самцы мышей Miwi ^{+ / DB} -Cre были бесплодны, тогда как самки имели нормальную фертильность. Таким образом, модель на мышах точно воспроизводила фенотип человеческого заболевания у пациента с азооспермией. Гистопатологическая оценка семенников мышей Miwi ^{+ / DB} -Cre показала, что конденсированные сперматиды на этапах 14–16 значительно уменьшились в семенных канальцах семенников Miwi ^{+ / DB} -Cre и у мышей были на 25% легче семенников контрольных мышей.

«Нарушение обмена гистонов на протамин является потенциальным основным механизмом»

Исследования функции сперматозоидов показали незначительное движение и прогрессирование сперматозоидов, продуцируемых мышами Miwi ^{+ / DB} -Cre, и что их способность оплодотворять ооциты была существенно нарушена. Большая часть сперматозоидов Miwi ^{+ / DB} -Cre показала аномально изогнутые задние головки с эффективным окрашиванием ядер кислым анилином, что указывает на плохо конденсированный хроматин.Анализ транскриптома и уровня пиРНК в сперматидах, удлиняющих Miwi ^{+ / DB} -Cre, выявил лишь незначительные различия у мышей с нокаутом и контрольных мышей, что позволяет предположить, что мутации D-бокса не влияют существенно на экспрессию генов. Однако протеомный анализ показал значительную повышающую регуляцию уровней гистонов h3A, h3B, h4, h5 и их вариантов в сперматозоидах Miwi ^{+ / DB} -Cre и связанное с этим подавление протаминов PRM1 и PRM2. Вестерн-блоттинг показал значительное снижение протаминов PRM2 и PRM2, что позволяет предположить, что нарушение обмена гистонов на протамины является потенциальным основным механизмом, объясняющим функциональные нарушения в нокаутированных сперматозоидах и их человеческих аналогах.

Ссылки

1
Gou, L.-T. и др. . Мутации с дефицитом убиквитинирования у человека Piwi вызывают мужское бесплодие, нарушая обмен гистонов на протамин во время спермиогенеза. Ячейка 169 , 1090–1104.e13 (2017)
CAS Статья Google Scholar

Скачать ссылки

Об этой статье

Цитировать эту статью

Fenner, A. Piwi , Hiwi , Miwi : важные гены для эффективного спермиогенеза. Нат Рев Урол 14, 451 (2017). https://doi.org/10.1038/nrurol.2017.95

Ссылка для скачивания

Piwil1 — Piwi-подобный белок 1 — Mus musculus (Мышь)

Функциональный ключ	Позиция (я)	Описание Действия	Длина
Этот подраздел «Патология и биотехнология» описывается влияние экспериментальной мутации одной или нескольких аминокислот на биологические свойства белка. p> Подробнее … Мутагенез ⁱ	218 — 221	RRLL → ARLA: не влияет на piRNA- связывание, но отменяет убиквитинирование APC / C. Вызывает мужскую стерильность. Ручное утверждение, основанное на эксперименте в ⁱ «убиквитинирование MIWI, запускаемое piRNA, и удаление APC / C в позднем сперматогенезе.» Zhao S., Gou LT, Zhang M., Zu LD, Hua MM, Hua Y., Shi HJ, Li Y., Li J., Li D., Wang ED, Liu MF Dev. Cell 24: 13-25 (2013) [PubMed] [Europe PMC] [Abstract] Цитируется по: УБИКВИТИНАЦИЯ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ANAPC10, ДОМЕН, МУТАГЕНЕЗ 218-ARG — LEU-221; 330-LYS — LYS-335 И 346-TYR-TYR-347. «Мутации с дефицитом убиквитинирования в Piwi человека вызывают мужское бесплодие, нарушая обмен гистонов на протамин во время спермиогенеза.» Gou LT, Kang JY, Dai P., Wang X., Li F., Zhao S., Zhang M., Hua MM, Lu Y., Zhu Y., Li Z., Chen H., Wu LG. , Li D., Fu XD, Li J., Shi HJ, Liu MF Cell 169: 1090-1104 (2017) [PubMed] [Europe PMC] [Abstract] Цитируется по: ФУНКЦИЯ, УБИКВИТИНАЦИЯ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С RNF8 , МУТАГЕНЕЗ 218-ARG — LEU-221.	4
Мутагенез ⁱ	330 — 335	KSTFKK → ASTFAAquit: Отменяет APTFKK → ASTFAAquit: Отменяет. Ручное утверждение, основанное на эксперименте ⁱ «убиквитинирование MIWI, запускаемое piRNA, и удаление APC / C в позднем сперматогенезе». Zhao S., Gou L.T., Zhang M., Zu L.D., Hua M.M., Hua Y., Shi H.J., Li Y., Li J., Li D., Wang E.D., Liu M.F. Dev. Cell 24: 13-25 (2013) [PubMed] [Europe PMC] [Abstract] Цитируется по: УБИКВИТИНАЦИЯ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ANAPC10, ДОМЕН, МУТАГЕНЕЗ 218-ARG — LEU-221; 330-LYS — LYS-335 И 346-TYR-TYR-347.	6
Мутагенез ⁱ	343	F → A: Нарушает связывание с 2′-O-метилированным 3′-концом пиРНК. Ручное утверждение, основанное на эксперименте в ^и Цитируется по: СТРУКТУРА ЯМР 276-395 В КОМПЛЕКСЕ С МЕТИЛИРОВАННОЙ МАЛЕНЬКОЙ РНК, ДОМЕННОЙ ПАЗ, МУТАГЕНЕЗОМ PHE-343 И MET-382, ФУНКЦИЯ.	1
Мутагенез ⁱ	346-347	YY → AA: отменяет связывание пиРНК и убиквитинирование под действием APC / C. Ручное утверждение, основанное на эксперименте ⁱ «убиквитинирование MIWI, запускаемое piRNA, и удаление APC / C в позднем сперматогенезе». Zhao S., Gou L.T., Zhang M., Zu L.D., Hua M.M., Hua Y., Shi H.J., Li Y., Li J., Li D., Wang E.D., Liu M.F. Dev. Cell 24: 13-25 (2013) [PubMed] [Europe PMC] [Abstract] Цитируется по: УБИКВИТИНАЦИЯ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ANAPC10, ДОМЕН, МУТАГЕНЕЗ 218-ARG — LEU-221; 330-LYS — LYS-335 И 346-TYR-TYR-347.	2
Мутагенез ⁱ	382	M → A: Нарушает связывание с 2′-O-метилированным 3′-концом piRNA. Ручное утверждение, основанное на эксперименте в ^и Цитируется по: СТРУКТУРА ЯМР 276-395 В КОМПЛЕКСЕ С МЕТИЛИРОВАННОЙ МАЛЕНЬКОЙ РНК, ДОМЕННОЙ ПАЗ, МУТАГЕНЕЗОМ PHE-343 И MET-382, ФУНКЦИЯ.	1
Мутагенез ⁱ	633	D → A в мутанте DAH; вызывает мужское бесплодие из-за дерепрессии транскриптов ретротранспозонов LINE1. Ручное утверждение на основе эксперимента в ⁱ Цитируется по: ФУНКЦИЯ, КОФАКТОР, МУТАГЕНЕЗ ASP-633.	1

Антитело Miwi (D478) | Технология сотовой сигнализации

Ограниченное использование

За исключением случаев, когда иное прямо согласовано в письменной форме, подписанной законным представителем CST, следующие условия применяются к Продуктам, предоставляемым CST, ее филиалами или дистрибьюторами.Любые условия и положения Клиента, которые находятся в дополняют или отличаются от содержащихся в настоящем документе, если иное не принято в письменной форме юридически уполномоченным представитель CST, отклоняются и не имеют силы.

Продукты имеют маркировку «Только для исследовательского использования» или аналогичное заявление о маркировке и не были одобрены, одобрены или лицензированы. FDA или другой регулирующей иностранной или отечественной организацией для любых целей. Заказчик не должен использовать какой-либо Продукт для диагностики. или в терапевтических целях, или иным образом любым способом, который противоречит заявлению на этикетке.Продукты, продаваемые или лицензируемые CST предоставляются Заказчику как конечному пользователю и исключительно для целей исследований и разработок. Любое использование Продукта для диагностики, в профилактических или терапевтических целях, или любая покупка Продукта для перепродажи (отдельно или в качестве компонента) или в других коммерческих целях, требуется отдельная лицензия от CST. Клиент обязуется (а) не продавать, лицензировать, ссужать, жертвовать или иным образом передавать или предоставлять любой Продукт для любой третьей стороны, отдельно или в сочетании с другими материалами, или использовать Продукты для производства любых коммерческие продукты, (б) не копировать, изменять, реконструировать, декомпилировать, дизассемблировать или иным образом пытаться обнаружить лежащие в основе структуру или технологию Продуктов, или использовать Продукты с целью разработки любых продуктов или услуг, которые конкурировать с продуктами или услугами CST, (c) не изменять и не удалять из Продуктов какие-либо товарные знаки, торговые наименования, логотипы, патенты или уведомления об авторских правах или маркировка, (d) использовать Продукты исключительно в соответствии с Условия продажи продуктов CST и любые применимые документации, и (e) соблюдать любую лицензию, условия обслуживания или аналогичное соглашение в отношении любых сторонних продуктов или услуги, используемые Клиентом в связи с Продуктами.

Начальное разделение функций MIWI и MILI на основе митохондриальной мембраны во время биогенеза пахитеновых пиРНК | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

РНК, взаимодействующих с PIWI (piRNA), задействуют белки PIWI, чтобы заглушить транспозоны и способствовать развитию зародышевых клеток у животных. У различных видов биогенез piRNA происходит вблизи поверхности митохондрий и включает в себя закрепленные за митохондриальной мембраной факторы. У мышей два цитоплазматических белка PIWI, MIWI и MILI, получают процессированные пиРНК пахитена в межмитоходриальном цементе (IMC).Однако, как MIWI и MILI первоначально привлекаются к IMC для участия в нескольких этапах процессинга piRNA, неясно. Здесь мы показываем, что заякоренная в митохондриях TDRKH контролирует несколько стадий биогенеза pachytene piRNA у мышей. TDRKH специально задействует MIWI, но не MILI, чтобы задействовать путь piRNA. Это необходимо для продукции всей популяции MIWI-связанных пиРНК и позволяет обрезать MILI-связанные пиРНК. Невозможность рекрутирования MIWI в IMC с дефицитом TDRKH приводит к потере MIWI в хроматоидном теле, что приводит к остановке спермиогенных факторов и репрессии piRNA-независимого ретротранспозона LINE1 в круглых сперматидах.Наши результаты идентифицируют митохондриальный поверхностный каркасный механизм, разделяющий вход и действие двух критических белков PIWI в одном и том же пути piRNA, чтобы управлять биогенезом piRNA и развитием зародышевых клеток.

ВВЕДЕНИЕ

РНК, индуцированная слабым семенником (PIWI), взаимодействующая с РНК (пиРНК), представляет собой основной класс малых регуляторных РНК, которые играют эволюционно законсервированные роли в зародышевой линии животных, подавляя вредные транспозоны и способствуя развитию зародышевых клеток (1-7).Белки PIWI представляют собой эффекторные белки, управляемые связанными piRNAs (24–32nt), чтобы налагать специфичную для последовательности регуляцию экспрессии генов в половых клетках (8–12). У разных видов разные ортологи PIWI ассоциируют с разными популяциями piRNA на разных стадиях развития зародышевых клеток для выполнения определенных функций. У мышей три белка PIWI (MIWI, MILI и MIWI2) связаны с двумя разными популяциями piRNA, специфичными для стадии развития (13). В эмбриональных / неонатальных зародышевых клетках MILI и MIWI2 связываются с богатыми последовательностями транспозонов фетальными piRNAs для подавления мобильных элементов и поддержания целостности генома зародышевой линии (11,12,14).В постнатальных зародышевых клетках MIWI и MILI вместо этого ассоциируют с бедными транспозонной последовательностью pachytene piRNAs, которые экспрессируются начиная с стадии пахитены мейоза, чтобы регулировать экспрессию мейотических и постмейотических генов (15-17). Пахитены piRNA уникальны для млекопитающих и имеют решающее значение для сперматогенеза взрослых мышей.

Производство pachytene piRNA включает процессинг длинных РНК-предшественников piRNA в короткие PIWI-связанные piRNA (13,18). Биогенез пиРНК, как полагают, происходит в специализированной структуре, называемой межмитохондриальным цементом (IMC), электронно-плотной немембранной структуре, расположенной между митохондриями в пахитенных сперматоцитах и содержащей множество эволюционно консервативных факторов биогенеза piRNA (19-21).Генетические данные указывают на существование нескольких промежуточных стадий биогенеза pachytene piRNA, которые включают расщепление предшественников РНК на короткие промежуточные piRNA, промежуточные продукты piRNA, обрезание 3′-концов триммером и метилирование 3′-концов (22-26). Перед созреванием 3′-конца piRNA промежуточные соединения piRNA загружаются в MIWI и MILI, а PNLDC1 недавно был идентифицирован как триммер, необходимый для обрезки 3′-концов как MIWI-, так и MILI-piRNAs (22-24). Однако то, как MIWI и MILI изначально привлекаются к IMC для участия на ранних этапах процессинга piRNA и их связи со этапами созревания piRNA, менее понятны.

MIWI и MILI — два схожих цитоплазматических белка PIWI, содержащие одинаковую доменную архитектуру. Оба они необходимы для сперматогенеза у взрослых мышей (27,28). Оба они высоко экспрессируются в сперматоцитах пахитенов и связаны практически с одним и тем же набором видов пиРНК пахитенов (15,29). После мейоза MIWI и MILI также локализуются и концентрируются в хроматоидном теле (CB), большой одиночной электронно-плотной структуре для регуляции РНК в круглых сперматидах (20,21). MIWI и MILI выполняют важные функции подавления транспозонов в пахитеновых сперматоцитах.Однако их роли в замалчивании транспозонов круглых сперматид расходятся после мейоза, при этом MIWI необходим для замалчивания ретротранспозона LINE1, но MILI становится необязательным для репрессии LINE1 (8,9).

Tudor и KH домен-содержащий (TDRKH или TDRD2) является консервативным митохондриальным белком Tudor домена, который играет критическую роль в обрезке piRNA во время созревания 3′-конца piRNA у многих видов (30–32). У мышей TDRKH тесно ассоциирует с триммером PNLDC1, чтобы облегчить обрезку piRNA во время биогенеза piRNA плода (22-24).Глобальный нокаут Tdrkh у мышей приводит к дефекту обрезки пиРНК и остановке сперматогена перед стадией пахитена мейотической профазы I (30). Но эта остановка зародышевых клеток происходит раньше, чем у мышей с нокаутом Pnldc1 , что указывает на то, что TDRKH имеет дополнительные функции помимо облегчения обрезки piRNA (22). Помимо своей ассоциации с PNLDC1, TDRKH также напрямую связывается с белками PIWI у различных видов (33–35). У мышей TDRKH предпочтительно связывается с MIWI, но в меньшей степени с MILI во взрослых семенниках (36,37).Такое дифференциальное связывание указывает на то, что TDRKH может по-разному регулировать MIWI и MILI.

Здесь мы предоставляем новые генетические доказательства того, что механизмы рекрутирования MIWI и MILI различны в начале биогенеза piRNA. Путем условного удаления TDRKH в постнатальных половых клетках у мышей и исследований in vitro на основе клеток мы обнаружили, что TDRKH является белком митохондриальной мембраны, который специфически рекрутирует MIWI, но не MILI, для управления биогенезом pachytene piRNA. TDRKH контролирует производство всего спектра MIWI-piRNA.TDRKH связывает PNLDC1 с митохондриями и требуется для обрезки MILI-piRNA. Неожиданно, преимущественное привлечение MIWI с помощью TDRKH к IMC также является критическим для MIWI, но не для MILI, локализации в хроматоидном теле круглых сперматид, что, в свою очередь, является критическим для подавления транспозонов в гаплоидных зародышевых клетках и для спермиогенеза. Эти результаты выявляют митохондриальный поверхностный каркасный механизм, который сочетает рекрутирование специфических белков PIWI и обрезку piRNA, необходимых для разделения нижестоящих эффекторных функций различных белков PIWI.Эти находки также подтверждают видовое разнообразие в митохондриальной TDRKH-опосредованной сборке аппарата процессинга piRNA.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Заявление об этике

Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета штата Мичиган. Все эксперименты с мышами проводились с соблюдением этических норм в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и руководящими принципами учреждения.

Штаммы мышей

Tdrkh ^tm1a мыши были приобретены из лаборатории Джексона. Для генерации аллеля Tdrkh ^fl с экзоном 3, фланкированным сайтами loxP, гетерозиготных Tdrkh ^tm1a животных скрещивали с трансгенными мышами, экспрессирующими FLP (лаборатория Джексона), для удаления последовательностей, фланкированных FRT. Tdrkh ^{fl / +} самцов скрещивали с Tdrkh ^{fl / +} самок с получением гомозиготных мышей Tdrkh ^{fl / fl} .Для создания мышей с условным нокаутом Stra8-Cre Tdrkh ( Tdrkh ^cKO ) трансгенных мышей Stra8 -Cre (лаборатория Джексона) скрещивали с мышами Tdrkh ^{fl / fl} . Праймерами для ПЦР для генотипирования мышей Tdrkh ^{fl / fl} являются: 5′-TGTCAGATGAGAGGCAGCAG-3 ‘и 5′-CCATTTGGCATTTTCTTTGG-3’. Аллель дикого типа дает продукт размером 228 п.н .; Аллель Tdrkh ^fl давал продукт размером 397 пар оснований. Праймеры для ПЦР Stra8-Cre были описаны ранее (29).

Мыши с нокаутом Miwi ( Miwi ^{— / —} ), полученные в лаборатории доктора Хайфана Линя (27), были приобретены в Центрах исследования ресурсов мутантных мышей. Мыши Mov10l1 flox ( Mov10l1 ^{fl / fl} ), полученные в лаборатории доктора Эрика Олсона, были приобретены в лаборатории Джексона (38). Для создания мышей с условным нокаутом Mov10l1 ( Mov10l1 ^cKO ) мышей Mov10l1 ^{fl / fl} скрещивали с мышами Stra8-Cre (лаборатория Джексона). Tdrkh мышей с нокаутом ( Tdrkh ^{tm1b (KOMP) Wtsi} , а также Tdrkh ^{— / —} ) были приобретены в лаборатории Джексона. Мышей с нокаутом Pnldc1 ( Pnldc1 ^{— / —} ) получали, как описано (22).

Конструкция плазмиды

Полноразмерные кДНК мыши Miwi, Mili, Miwi2 и Pnldc1 амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в вектор pEGFP-C1, который содержит N-концевую метку GFP.Полноразмерные кДНК мыши Tdrkh (1–560aa), Tdrkh-ΔTM (35–560aa) и мутант Tdrkh-ΔTud (D390A / F391A) были амплифицированы с помощью ПЦР и клонированы в вектор pEGFP-N1 который содержит C-концевой тег GFP. Для получения плазмид TDRKH, TDRKH-ΔTM и TDRKH-ΔTud с C-концевой RFP-меткой указанные кДНК клонировали в модифицированный вектор pEGFP-C1 с заменой GFP на красный флуоресцентный белок (TurboRFP). Для получения плазимид TDRKH и PNLDC1, меченных FLAG, полноразмерные кДНК Tdrkh и Pnldc1 клонировали в модифицированный вектор pcDNA3, кодирующий FLAG-тег.

Гистология

Семенники и придатки яичка мыши фиксировали фиксатором Буэна в PBS при 4 ° C в течение ночи и заливали парафином. Срезы размером 5 мкм вырезали и окрашивали гематоксилином и эозином после депарафинизации и регидратации.

Иммунофлуоресценция

семенников фиксировали в 4% PFA в PBS в течение ночи при 4 ° C и заливали парафином. Срезы размером 5 мкм были вырезаны, депарафинированы и регидратированы. Получение антигена проводили путем обработки срезов в микроволновой печи в 0.01 М натрий-цитратный буфер (pH 6,0). После промывания PBS срезы тканей блокировали в 5% нормальной козьей сыворотке (NGS) в течение 30 минут при комнатной температуре (RT). Затем срезы семенников инкубировали с анти-MIWI (1: 100; 2079, Cell Signaling Technology), анти-MILI (1: 100; PM044, MBL), анти-TDRKH (1: 100; 13528-1-AP, Proteintech). , анти-AIF (1: 100; 5318, Cell Signaling Technology), анти-ACRV1 (1:50; 14040-1-AP, Proteintech), анти-GASZ (1:50; 21550-1-AP, Proteintech), анти-MVH (1: 100; Ab27591, Abcam), анти-TOMM20 (1:50; sc-17764, Santa Cruz Biotechnology), анти-LINE1 ORF1 (1: 800) или мышиный анти-γh3AX, конъюгированный с FITC (1 : 500; 16–202A, Millipore) в 5% NGS при 37 ° C в течение 2 часов.После промывки PBS срезы инкубировали с козьим антителом против кроличьего IgG Alexa Fluor 555 (1: 500; A21429, Life Technologies) и / или с козьим антителом против мышиного IgG Alexa Fluor 488 (1: 500; A11029, Life Technologies) в течение 1 раза. ч при комнатной температуре и закрепили с помощью монтажной среды Vectorshield с DAPI (h2200, Vector Laboratories) после промывки. Флуоресцентную микроскопию проводили на конфокальном микроскопе Fluoview FV1000 (Olympus, Япония).

Иммунофлуоресценция клеток HeLa

клеток HeLa трансфицировали указанными плазмидами.Через 48 часов после трансфекции клетки окрашивали 100 нМ Mitotracker Red Probes (M7512, Thermo Scientific) при 37 ° C в течение 30 минут и фиксировали 3,7% формальдегидом при 37 ° C в течение 15 минут. После промывки PBS клетки были закреплены с использованием монтажной среды Vectorshield с DAPI (h2200, Vector Laboratories). Флуоресцентную микроскопию проводили на конфокальном микроскопе Fluoview FV1000 (Olympus, Япония).

Просвечивающая электронная микроскопия

семенники мыши были зафиксированы в 0.1 M какодилатный буфер с добавлением 2,5% глутаральдегида и 2% PFA в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания 0,1 М какодилатным буфером семенники постфиксировали в 0,1 М какодилатном буфере с добавлением 1% тетроксида осмия в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания семенники обезвоживали в увеличивающихся концентрациях ацетона, а затем пропитывали и заливали в Spurr. Тонкие срезы размером 70 нм получали на ультрамикротоме Power Tome (Boeckeler Instruments, США) и затем окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца.Изображения были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEOL 100CX (Японская лаборатория электронной оптики, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ.

Вестерн-блоттинг

Семенники мышей собирали и гомогенизировали с использованием буфера RIPA (50 мМ Трис · HCl pH 7,4, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,01% SDS, 1 мМ EDTA и 150 мМ NaCl). Лизаты белков разделяли с помощью 4–20% геля SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF (Bio-Rad). Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке и затем инкубировали с первичными антителами в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° C.Мембраны промывали TBST и инкубировали с HRP-конъюгированными козьими антикроличьими IgG (1: 5000; 1706515, Bio-Rad) или козьими антимышиными IgG (1: 5000; 1706516, Bio-Rad) в течение 1 ч перед хемилюминесцентным обнаружением. . В качестве первичных используемых антител были: анти-TDRKH (1: 4000; 13528-1-AP, Proteintech), анти-MIWI (1: 1000; 2079, Cell Signaling Technology), анти-MILI (1: 2000; PM044, MBL). и конъюгированный с HRP мышиный анти-β-актин (1: 5000; A3854, Sigma).

Коиммунопреципитация

Клетки

HEK293T трансфицировали указанными плазмидами с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies).Через 48 часов лизаты клеток обрабатывали РНКазой A (500 мкг / мл) или без нее в течение 3 часов при 4 ° C, а затем 30 минут при комнатной температуре. Иммунопреципитацию проводили с использованием аффинного геля anti-FLAG M2 (A2220, Sigma). Белки, меченные FLAG или GFP, выявляли вестерн-блоттингом с использованием антитела против FLAG (1: 1000; F1804, Sigma) и антитела против GFP (1:10 000; Ab290, Abcam).

Иммунопреципитация пиРНК

Семенники мышей собирали и гомогенизировали с использованием буфера для лизиса (20 мМ HEPES, pH 7.3, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl ₂, 0,2% NP-40 и 1 мМ DTT) с смесью ингибиторов протеаз (Thermo Scientific) и ингибиторов РНКаз (Promega). После обработки ультразвуком лизаты семенников центрифугировали при 12 000 об / мин в течение 10 мин. Супернатанты предварительно очищали с использованием бусинок агарозы с протеином А (Roche) в течение 2 часов. Антитела против MILI (PM044, MBL) или против MIWI (2079, Cell Signaling Technology) вместе с гранулами агарозы с протеином A добавляли к лизатам и инкубировали в течение 4 часов. Гранулы промывали буфером для лизиса пять раз.Иммунопреципитированные РНК выделяли из шариков с использованием реагента Trizol (Thermo Scientific) для мечения piRNA или конструирования библиотеки малых РНК. Для обнаружения белка иммунопреципитированные шарики кипятили в буфере для загрузки белка в течение 5 мин. Вестерн-блоттинг MILI или MIWI выполняли, как описано выше. Для создания библиотеки малых РНК общее количество белка MILI или MIWI было сопоставлено между образцами дикого типа и образцами Tdrkh ^cKO после иммунопреципитации для выделения РНК, чтобы гарантировать прямое сопоставление результатов секвенирования.

Обнаружение пиРНК

Суммарную РНК экстрагировали из семенников мышей с использованием реагента Trizol (Thermo Scientific). Тотальную РНК (1 мкг) или иммунопреципитированную РНК (MILI или MIWI) дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветок (NEB) и метили по концам с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (NEB) и [γ- ³² P] АТФ. РНК, меченная ³² P, была разделена на 15% мочевине-PAGE геле, и сигналы были обнаружены путем экспонирования геля на экране фосфорного визуализатора с последующим сканированием на сканере Typhoon (GE Healthcare).

Малые библиотеки РНК и биоинформатика

Библиотеки малых РНК

из иммунопреципитированных РНК или общей РНК получали с использованием набора для подготовки библиотеки малых РНК NEBNext® Multiplex (E7300, NEB) в соответствии с инструкциями производителя. Несколько библиотек с разными штрих-кодами были объединены и секвенированы с помощью платформы Illumina HiSeq 4000 (MSU Genomic Core Facility).

Последовательные чтения были обработаны с помощью fastx_clipper (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html), чтобы вырезать сквозное чтение адаптера секвенирования. Обрезанные чтения фильтровали по длине (24–48 нуклеотидов) и выравнивали по следующим наборам последовательностей: кластеры пиРНК, кодирующие РНК, некодирующие РНК, повторы и интрон. Считывания, не сопоставленные с указанными выше пятью наборами последовательностей, были классифицированы как «прочие». Выравнивания выполняли с помощью Bowtie (допускается одно базовое несоответствие). Повторы включают классы повторов, как определено RepeatMasker (ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/database/rmsk.txt.gz).

5′-5 ‘и 3′-3’ дистанционный анализ пиРНК и промежуточных продуктов пиРНК

24–48 нуклеотидов чтения из библиотеки дикого типа или Tdrkh ^cKO MILI-piRNA библиотек были отдельно картированы в кластеры piRNA.Рассматривался только идеальный матч. Верхние 10000 четко картированных piRNA из библиотек MILI-piRNA дикого типа были извлечены и использовались в качестве ссылок на положения. Для анализа расстояния 5’– 5 ‘промежуточного соединения piRNA-piRNA 5′-концевые положения 10 000 верхних ссылок piRNA были определены как положение 0; измеряли плотность картированных 5’-концов piRNA из Tdrkh ^cKO библиотек MILI-piRNA в окне 60 нуклеотидов (-30 нуклеотидов → + 30 нуклеотидов). Частоту 5′-концов пиРНК в каждом положении наносили на график.Для 3′-3′-дистанционного анализа промежуточного соединения piRNA-piRNA, 3′-концевые положения 10 000 верхних ссылок piRNA были определены как положение 0; измеряли плотность картированных 3′-концов piRNA из Tdrkh ^cKO библиотек MILI-piRNA в окне 60 нт (-30 нт → + 30 нт). Частоту 3′-концов пиРНК в каждом положении наносили на график.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Условная делеция

Tdrkh в послеродовых половых клетках приводит к остановке спермиогенных клеток

Чтобы определить специфическое участие TDRKH в регуляции PIWI и биогенезе pachytene piRNA в постнатальных половых клетках, мы генерировали Tdrkh мышей с условным нокаутом ( Tdrkh ^cKO ), у которых Tdrkh было удалено на 3-й день постнатального развития. по Stra8 трансген -Cre (29,39).Мы использовали условный аллель Tdrkh ( Tdrkh ^fl ) с экзоном 3 Tdrkh , фланкированным двумя сайтами loxP. Этот аллель был получен из целевого аллеля «нокаут-первым» в результате рекомбинации, опосредованной FLP (рис. 1A). Объединив Tdrkh ^fl с Stra8 -Cre, мы получили Stra8 -Cre ⁺, Tdrkh ^{fl / —} мышей с условным нокаутом с Tdrkh с делецией зародышевых клеток во всех взрослых клетках.Мы подтвердили успешную инактивацию TDRKH с помощью иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга, которые показали отсутствие белка TDRKH во взрослых половых клетках и семенниках, соответственно (рис. 1B и C). Мыши Tdrkh ^cKO показали меньшие размеры семенников со средним значением 50% веса контрольных семенников дикого типа (рис. 1D). Вес яичек Tdrkh ^cKO в два раза выше, чем у мышей Tdrkh ^{— /} ^—, что позволяет предположить, что половые клетки Tdrkh ^cKO задерживаются на более поздней стадии, чем Tdrkh. — / — мышей.Гистологическое исследование срезов семенников Tdrkh ^cKO показало, что зародышевые клетки в основном задерживались на стадии круглых сперматид (80%), а 20% семенных канальцев задерживались на стадии сперматоцитов зиготены (рисунок 1E и дополнительный рисунок S1). Это контрастирует с Tdrkh ^{— /} ^— мышами, которые обнаруживают полную остановку мейоза на стадии зиготены (22,30). Анализ придатка яичка Tdrkh ^cKO показал многочисленные круглые сперматидоподобные клетки (рис. 1F).Дальнейшее исследование показывает, что круглые сперматиды Tdrkh ^cKO были арестованы перед этапом 5, потому что в арестованных сперматидах наблюдались только гранулы проакросом, но не акросомы (рис. 1G). Вместе эти результаты показывают, что постнатальная экспрессия TDRKH является критической для развития сперматид и спермиогенеза.

Рисунок 1.

Потеря TDRKH в постнатальных мужских половых клетках вызывает остановку сперматогена у мышей. ( A ) Схематическая диаграмма, показывающая стратегию нацеливания на гены для генерации условного аллеля Tdrkh .Cre-опосредованная делеция удаляла экзон 3 Tdrkh и генерировала нулевой аллель белка. ( B ) Иммуноокрашивание TDRKH у взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм. ( C ) Вестерн-блоттинг экспрессии TDRKH в семенниках взрослых WT и Tdrkh ^cKO . β-Актин служил контролем нагрузки. ( D ) Атрофия яичек у мышей Tdrkh ^cKO . Показаны размеры и вес яичек взрослых мышей WT, Tdrkh ^cKO и Tdrkh ^{— /} ^— . n = 8. Планки погрешностей представляют s.e.m. Значение P было рассчитано с использованием непарного теста t . ** P <0,01. ( E ) Сперматогенная остановка в яичках Tdrkh ^cKO . Показаны окрашенные гематоксилином и эозином срезы семенников взрослых мышей WT и Tdrkh ^cKO мышей. Масштабные линейки, 20 мкм. Р, пахитеновые сперматоциты; R — круглые сперматиды; Сперма, сперматозоиды. ( F ) Показаны срезы придатка яичка, окрашенные гематоксилином и эозином, от взрослых мышей WT и Tdrkh ^cKO мышей.Шкала 100 мкм. ( G ) Сперматогенная остановка на стадии круглой сперматиды в яичках Tdrkh ^cKO . Совместное иммуноокрашивание ACRV1 и γh3AX в семенных канальцах стадии VII – VIII от WT и Tdrkh ^cKO семенников. ДНК окрашивали DAPI. Масштабная линейка 20 мкм.

Рисунок 1.

TDRKH необходим для биогенеза pachytene piRNA

Чтобы определить роль TDRKH в биогенезе пиРНК пахитен, мы исследовали численность и размер популяций пиРНК во взрослых семенниках дикого типа и Tdrkh ^cKO .Радиомечение общих малых РНК выявило ожидаемую популяцию piRNA дикого типа длиной около 30nt, однако эта популяция piRNA отсутствовала в яичках Tdrkh ^cKO (рис. 2A). Секвенирование библиотек малых РНК, построенных из общей РНК, подтвердило близкое истощение всей популяции piRNA в Tdrkh ^cKO семенниках после нормализации с помощью количества miRNA (Рисунок 2B).

Рисунок 2.

Увеличение длины пиРНК и снижение уровня пиРНК в семенниках взрослых Tdrkh ^cKO .( A ) Сильное снижение общего количества пиРНК в Tdrkh ^cKO семенниках. Общая РНК от взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников были помечены концевыми метками [³² P] -АТФ и обнаружены с помощью 15% геля мочевины TBE и авторадиографии. ( B ) Распределение длин малых РНК от взрослых WT и Tdrkh ^cKO библиотек малых РНК яичек. Данные были нормализованы чтением miRNA (21–23nt). ( C ) Расширение MILI-piRNA в Tdrkh ^cKO семенниках.Малые РНК выделяли из иммунопреципитированных MILI-RNP, метили на конце [³² P] -АТФ и детектировали с помощью 15% геля мочевины TBE и авторадиографии. Вестерн-блоттинг выполняли с использованием антител против MILI, чтобы показать эффективность иммунопреципитации. Квадратная скобка указывает на удлиненные пиРНК. M: маркер молекулярной массы. ( D ) Уменьшение MIWI-piRNAs в Tdrkh ^cKO семенниках. Малые РНК выделяли из иммунопреципитированных MIWI-RNP, метили на конце [³² P] -ATP и детектировали с помощью 15% геля мочевины TBE и авторадиографии.Вестерн-блоттинг проводили с использованием антител против MIWI, чтобы показать эффективность иммунопреципитации. M: маркер молекулярной массы. ( E ) Распределение длин MILI-piRNAs из взрослых WT и Tdrkh ^cKO MILI-piRNA библиотек. ( F ) Распределение длин MIWI-piRNA из взрослых WT и Tdrkh ^cKO библиотек MIWI-piRNA.

Рисунок 2.

Увеличение длины пиРНК и снижение уровня пиРНК у взрослых Tdrkh ^cKO семенников.( A ) Сильное снижение общего количества пиРНК в Tdrkh ^cKO семенниках. Общая РНК от взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников были помечены концевыми метками [³² P] -АТФ и обнаружены с помощью 15% геля мочевины TBE и авторадиографии. ( B ) Распределение длин малых РНК от взрослых WT и Tdrkh ^cKO библиотек малых РНК яичек. Данные были нормализованы чтением miRNA (21–23nt). ( C ) Расширение MILI-piRNA в Tdrkh ^cKO семенниках.Малые РНК выделяли из иммунопреципитированных MILI-RNP, метили на конце [³² P] -АТФ и детектировали с помощью 15% геля мочевины TBE и авторадиографии. Вестерн-блоттинг выполняли с использованием антител против MILI, чтобы показать эффективность иммунопреципитации. Квадратная скобка указывает на удлиненные пиРНК. M: маркер молекулярной массы. ( D ) Уменьшение MIWI-piRNAs в Tdrkh ^cKO семенниках. Малые РНК выделяли из иммунопреципитированных MIWI-RNP, метили на конце [³² P] -ATP и детектировали с помощью 15% геля мочевины TBE и авторадиографии.Вестерн-блоттинг проводили с использованием антител против MIWI, чтобы показать эффективность иммунопреципитации. M: маркер молекулярной массы. ( E ) Распределение длин MILI-piRNAs из взрослых WT и Tdrkh ^cKO MILI-piRNA библиотек. ( F ) Распределение длин MIWI-piRNA из взрослых WT и Tdrkh ^cKO библиотек MIWI-piRNA.

Чтобы оценить, есть ли еще остаточные piRNA, связанные с белками PIWI в яичках Tdrkh ^cKO , мы иммунопреципитировали MILI и MIWI и пометили связанные малые РНК.В яичках Tdrkh ^cKO MILI ассоциировался с популяцией малых РНК с увеличенной длиной и с гораздо меньшей численностью по сравнению с диким типом (рис. 2С). Поразительно, что MIWI не ассоциировался с какими-либо детектируемыми piRNA в яичках Tdrkh ^cKO (Рисунок 2D). Секвенирование малых РНК библиотек, построенных из иммунопреципитированных малых РНК, подтвердило эти наблюдения, что MILI все еще ассоциируется с небольшим количеством протяженных малых РНК, в то время как MIWI связанные piRNA полностью отсутствуют (рис. 2E и F).Эти данные указывают на то, что постнатальная TDRKH важна для продукции пиРНК пахитена с дифференциальным эффектом на MILI-связанные и MIWI-связанные пиРНК.

TDRKH необходим для 3′-обрезки MILI-пиРНК

Чтобы понять характеристики остаточной расширенной популяции малой РНК Tdrkh ^cKO , связанной с MILI, мы сконструировали и секвенировали библиотеки малых РНК, полученные из РНК, выделенной из иммунопреципитированных MILI в семенниках дикого типа и Tdrkh ^cKO .Мы картировали 24–48nt чтения как из библиотек дикого типа, так и из Tdrkh ^cKO MILI-piRNA библиотек в геном мыши (22) и наблюдали, что, как и из дикого типа, в первую очередь были картированы Tdrkh ^cKO MILI-piRNA. к кластерам пиРНК (рис. 3А). Это указывает на то, что Tdrkh ^cKO MILI-РНК представляют собой удлиненные пиРНК, что согласуется с ролью TDRKH в обрезке пиРНК пахитен. Чтобы подтвердить, что TDRKH отвечает за обрезку 3′-концов piRNA, мы далее сравнили 5’– 5 ‘и 3’– 3’ расстояния между Tdrkh ^cKO MILI-piRNA дикого типа и Tdrkh.Графики частотного распределения показали преобладающий одиночный пик в положении 0 на расстоянии 5’– 5 ‘, указывая на то, что Tdrkh ^cKO MILI-РНК имеют одинаковые 5′-концы с MILI-piRNAs дикого типа (Рисунок 3B). График расстояний 3′-3 ‘показал, что 3’-концы Tdrkh ^cKO MILI-piRNA простираются вниз по течению, но не выше по течению от MILI-piРНК, что указывает на то, что Tdrkh ^cKO MILI-piRNA не обрезаны. на концах 3 ′ (рис. 3B). В соответствии с этим результатом первые нуклеотиды Tdrkh ^cKO MILI-piRNAs показали такое же сильное смещение U (рис. 3C).При картировании на специфические кластеры piRNA Tdrkh ^cKO MILI-piRNA соответствовали 5′-концам piRNA дикого типа, но демонстрировали удлинения 3′-концов, что указывает на дефектную 3′-обрезку piRNA у мышей Tdrkh ^cKO (рис. 3D). Такой дефект piRNA также наблюдался у мышей Pnldc1 ^{— / —} (дополнительный рисунок S2). Эти результаты демонстрируют, что, подобно своей важной роли в обрезке препахитен piRNA, TDRKH также участвует в обрезке 3′-концов pachytene piRNA во время сперматогенеза взрослых.

Рисунок 3.

Удлинение 3′-конца MILI-piRNAs в семенниках взрослых Tdrkh ^cKO . ( A ) Геномная аннотация MILI-piRNAs от взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Считывания последовательностей (24–48 нуклеотидов) из библиотек MILI-piRNA были сопоставлены с наборами геномных последовательностей мыши в следующем порядке: кластеры piRNA, кодирующая РНК, некодирующая РНК, повторы, интронные последовательности и другие. Отображается процент сопоставленных чтений.( B ) График плотности 5’– 5 ‘и 3’– 3’ расстояний между пиРНК дикого типа и Tdrkh ^cKO промежуточных продуктов пиРНК. Библиотеки 24–48nt чтения из WT и Tdrkh ^cKO MILI-piRNA были сопоставлены с кластерами piRNA. Лучшие 10000 четко картированных piRNA из библиотеки WT MILI-piRNA были извлечены в качестве ссылок. Частотное распределение расстояний 5′-концов отображенных считываний из библиотеки Tdrkh ^cKO MILI-piRNA и 5′-концов пиРНК (расстояние 5’– 5 ‘) и частотные распределения расстояний 3’-концов сопоставленных считываний из Tdrkh ^cKO Библиотека MILI-piRNA и ссылочный 3′-конец пиРНК (расстояние 3’– 3 ‘).( C ) Распределение нуклеотидов в первой позиции в MILI-piRNAs взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Использовали 24–48 чтений из библиотек MILI-piRNA. ( D ) Расширенная пиРНК 3 ‘заканчивается в Tdrkh ^cKO семенниках. Выравнивания между 31–48 нуклеотидами при чтении из библиотеки Tdrkh ^cKO MILI-piRNA и считывании 24–30 нуклеотидов из библиотеки WT MILI-piRNA в выбранной области из репрезентативного кластера piRNA. Геномное расположение кластера piRNA показано внизу.

Рисунок 3.

Удлинение 3′-конца MILI-piRNAs у взрослых Tdrkh ^cKO семенников. ( A ) Геномная аннотация MILI-piRNAs от взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Считывания последовательностей (24–48 нуклеотидов) из библиотек MILI-piRNA были сопоставлены с наборами геномных последовательностей мыши в следующем порядке: кластеры piRNA, кодирующая РНК, некодирующая РНК, повторы, интронные последовательности и другие. Отображается процент сопоставленных чтений. ( B ) График плотности 5’– 5 ‘и 3’– 3’ расстояний между пиРНК дикого типа и Tdrkh ^cKO промежуточных продуктов пиРНК.Библиотеки 24–48nt чтения из WT и Tdrkh ^cKO MILI-piRNA были сопоставлены с кластерами piRNA. Лучшие 10000 четко картированных piRNA из библиотеки WT MILI-piRNA были извлечены в качестве ссылок. Частотное распределение расстояний 5′-концов отображенных считываний из библиотеки Tdrkh ^cKO MILI-piRNA и 5′-концов пиРНК (расстояние 5’– 5 ‘) и частотные распределения расстояний 3’-концов сопоставленных считываний из Tdrkh ^cKO Библиотека MILI-piRNA и ссылочный 3′-конец пиРНК (расстояние 3’– 3 ‘).( C ) Распределение нуклеотидов в первой позиции в MILI-piRNAs взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Использовали 24–48 чтений из библиотек MILI-piRNA. ( D ) Расширенная пиРНК 3 ‘заканчивается в Tdrkh ^cKO семенниках. Выравнивания между 31–48 нуклеотидами при чтении из библиотеки Tdrkh ^cKO MILI-piRNA и считывании 24–30 нуклеотидов из библиотеки WT MILI-piRNA в выбранной области из репрезентативного кластера piRNA. Геномное расположение кластера piRNA показано внизу.

Полная потеря MIWI-piРНК в

Tdrkh ^cKO семенниках
Tdrkh ^cKO MILI-piRNAs значительно уменьшены в количестве и не триммированы, остается неясным, почему MIWI-piRNAs в Tdrkh ^cKO не были обнаружены. Чтобы изучить специфический механизм, с помощью которого TDRKH участвует в продукции MIWI-piRNA, мы сравнили экспрессию MIWI и дефект piRNA у мышей Tdrkh ^cKO с таковыми у мышей Pnldc1 ^{— / —} (22) и Stra8 . -Cre ⁺, Mov10l1 ^{fl / —} условный нокаут ( Mov10l1 ^cKO ) мышей (29).Эти два фактора биогенеза piRNA имеют решающее значение для продукции MIWI-piRNA. Экспрессия белка MIWI в яичках Tdrkh ^cKO была снижена по сравнению с семенниками дикого типа, и уровень снижения был аналогичен таковому в яичках Pnldc1 ^{— / —} и Mov10l1 ^cKO (дополнительный рисунок S3). PNLDC1 необходим для обрезки 3′-концов pachytene piRNA (22-24). Pnldc1 ^{— / —} семенников показали удлинение длины пиРНК и снижение уровней пиРНК.Однако снижение piРНК в семенниках Pnldc1 ^{— / —} меньше, чем в семенниках Tdrkh ^cKO , поскольку расширенные MILI-piRNA и MIWI-piRNA наблюдались в тестах Pnldc1 ^{— / —} (22). MOV10L1 — это РНК-геликаза, необходимая для процессинга пиРНК (40–43). Mov10l1 ^cKO семенников показали пониженный уровень пиРНК, аналогичный таковому у Tdrkh ^cKO семенников (дополнительные рисунки S4A и D). Однако мы по-прежнему наблюдали остаточные MILI-piRNA (дополнительные рисунки S4B и E) и MIWI-piRNA (дополнительные рисунки S4C и F) в яичках Mov10l1 ^cKO .В результате сниженный уровень белка MIWI и дефектная обрезка 3′-концов piRNA в семенниках Tdrkh ^cKO не могут полностью объяснить, почему MIWI-piRNAs в Tdrkh ^cKO полностью отсутствуют.
TDRKH требуется для MIWI, но не для локализации MILI на IMC
Затем мы исследовали локализацию MIWI и MILI в яичках Tdrkh ^cKO . TDRKH — это митохондриальный локализованный белок в мужских половых клетках (дополнительный рисунок S5) (30).Мы наблюдали, что сперматоциты Tdrkh ^cKO демонстрировали полярное распределение сильно сгруппированных агрегатов митохондрий (полярная конгломерация) с помощью электронной микроскопии (рис. 4A), фенотип, также наблюдаемый у Pnldc1 ^{— / —} и c Mov10l1 мыши (22,24,42). Иммунофлуоресценция GASZ и AIF, митохондриального локализованного фактора piRNA и митохондриального маркера, соответственно, подтвердила полярную кластеризацию митохондрий в сперматоцитах Tdrkh ^cKO (рис. 4B).В соответствии с кластеризацией митохондрий, MILI был локализован в агрегированных митохондриях в сперматоцитах Tdrkh ^cKO , что напоминает паттерн локализации GASZ и AIF (рис. 4C). Интересно, что локализация MIWI отличалась от MILI в сперматоцитах Tdrkh ^cKO с диффузной экспрессией по всей цитоплазме (рис. 4D). В отличие от этого, локализация MIWI в сперматоцитах Mov10l1 ^cKO была ограничена кластеризованными митохондриями (рис. 4D).Это говорит о том, что дефицит TDRKH избирательно влияет на локализацию MIWI, но не влияет на MILI на IMC. Чтобы дополнительно проверить влияние дефицита TDRKH на локализацию MIWI и MILI, мы совместно иммуноокрашивали MIWI и TOMM20 (митохондриальный маркер) или MILI и TOMM20 на диких типах, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKOper s. MIWI был избирательно диспергирован в Tdrkh ^cKO , но не в сперматоцитах Mov10l1 ^cKO , несмотря на явную кластеризацию митохондрий в обеих мутантных клетках (фигура 4E и дополнительная фигура S6).Это контрастирует с колокализацией MILI с TOMM20 в сперматоцитах Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO (рисунок 4F и дополнительный рисунок S7). Эти результаты показывают, что TDRKH требуется для MIWI, но не для локализации MILI в IMC. Это согласуется с выводом in vitro о том, что MILI взаимодействует с TDRKH в меньшей степени, чем MIWI (30,36) (дополнительный рисунок S8), предполагая, что регуляция MIWI и MILI биохимически и генетически разделены.
Рисунок 4.
Дефицит
TDRKH выборочно нарушает локализацию MIWI в митохондриях в сперматоцитах. ( A ) Потеря TDRKH вызывает агрегацию митохондрий в сперматоцитах. Просвечивающая электронная микроскопия была выполнена на пахитеновых сперматоцитах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Агрегация митохондрий обозначена пунктирной линией. Масштабная линейка 4 мкм. ( B ) Дефицит TDRKH вызывает агрегацию митохондриальных белков GASZ и AIF в сперматоцитах.Иммуноокрашивание проводили с использованием указанных антител на семенниках взрослых WT и Tdrkh ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. Белковые агрегации обозначены стрелками. Шкала 10 мкм. ( C, D ) Дефицит TDRKH вызывает агрегацию MILI (C), но не MIWI (D), в сперматоцитах. Иммуноокрашивание проводили с использованием указанных антител на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI.Белковые агрегации обозначены стрелками. Шкала 10 мкм. ( E ) Потеря TDRKH нарушает локализацию MIWI в митохондриях. Совместное иммуноокрашивание проводили с использованием антител MIWI и TOMM20 на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. TOMM20 служил митохондриальным маркером. Шкала 5 мкм. ( F ) Конгрегация MILI в тестах Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO .Совместное иммуноокрашивание проводили с использованием антител MILI и TOMM20 на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. TOMM20 служил митохондриальным маркером. Шкала 5 мкм.
Рисунок 4.

Дефицит TDRKH выборочно нарушает локализацию MIWI в митохондриях в сперматоцитах. ( A ) Потеря TDRKH вызывает агрегацию митохондрий в сперматоцитах. Просвечивающая электронная микроскопия была выполнена на пахитеновых сперматоцитах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников.Агрегация митохондрий обозначена пунктирной линией. Масштабная линейка 4 мкм. ( B ) Дефицит TDRKH вызывает агрегацию митохондриальных белков GASZ и AIF в сперматоцитах. Иммуноокрашивание проводили с использованием указанных антител на семенниках взрослых WT и Tdrkh ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. Белковые агрегации обозначены стрелками. Шкала 10 мкм. ( C, D ) Дефицит TDRKH вызывает агрегацию MILI (C), но не MIWI (D), в сперматоцитах.Иммуноокрашивание проводили с использованием указанных антител на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. Белковые агрегации обозначены стрелками. Шкала 10 мкм. ( E ) Потеря TDRKH нарушает локализацию MIWI в митохондриях. Совместное иммуноокрашивание проводили с использованием антител MIWI и TOMM20 на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI.TOMM20 служил митохондриальным маркером. Шкала 5 мкм. ( F ) Конгрегация MILI в тестах Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . Совместное иммуноокрашивание проводили с использованием антител MILI и TOMM20 на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. TOMM20 служил митохондриальным маркером. Шкала 5 мкм.

Мембранно-заякоренная TDRKH привлекает MIWI к митохондриям

Затем мы проверили, может ли TDRKH напрямую рекрутировать MIWI в митохондрии.TDRKH представляет собой митохондриальный локализованный белок с предполагаемой последовательностью митохондриальной локализации (MLS) на N-конце и двумя РНК-связывающими доменами KH и связывающим белок Tudor-доменом (30,36) (рисунок 5A и дополнительный рисунок S5). Зависимость TDRKH от MLS для митохондриальной локализации официально не доказана. Мы использовали гетерологичную систему экспрессии на основе клеток HeLa, в которой мы экспрессировали TDRKH-GFP и мутантный TDRKH с делецией трансмембранного домена (TDRKH-ΔTM-GFP). TDRKH-GFP совместно локализовался с митотрекером на митохондриях, тогда как TDRKH-ΔTM-GFP диффундировал в цитоплазму, что указывает на то, что MLS отвечает за автономную локализацию TDRKH на митохондриальной мембране (рис. 5B).Следовательно, TDRKH является митохондриальным белком, который автономно закрепляется на митохондриальной мембране через свой трансмембранный домен. Затем мы исследовали, может ли заякоренная в митохондриях TDRKH рекрутировать MIWI или MILI в митохондрии. Мы сконструировали и экспрессировали GFP-MIWI или GFP-MILI, оба показали диффузное распределение в цитоплазме при индивидуальной трансфекции в клетки HeLa (рис. 5C и D). При коэкспрессии с TDRKH-RFP, GFP-MIWI концентрируется на митохондриях, значительно перекрываясь с TDRKH-RFP, что свидетельствует о прямом привлечении MIWI с помощью митохондриальной заякоренной TDRKH (рис. 5C).Удаление сигнала TDRKH MLS диспергировало митохондриальную локализацию TDRKH и привело к соответствующей диффузии GFP-MIWI (рис. 5C). Напротив, коэкспрессия TDRKH-RFP и GFP-MILI не приводила к накоплению митохондрий MILI, что свидетельствует о неспособности заякоренных в митохондриях TDRKH рекрутировать MILI (рис. 5D). Чтобы определить, опосредуется ли рекрутирование MIWI TDRKH в митохондрии прямыми белок-белковыми взаимодействиями, мы совместно экспрессировали мутант TDRKH Tudor domain (D390A / F391A, мы называем TDRKH-ΔTud) с MIWI.Эта мутация в домене Тюдоров нарушает взаимодействие TDRKH с MIWI (36). TDRKH-ΔTud-GFP совместно локализуется с митотрекером на митохондриях в клетках HeLa, что указывает на то, что мутация домена Tudor не влияет на локализацию TDRKH (рис. 5B). Однако совместная экспрессия TDRKH-ΔTud-RFP и GFP-MIWI не позволяла накопление митохондрий MIWI (рис. 5C). Вместе эти данные показывают, что TDRKH избирательно рекрутирует MIWI, но не MILI, в митохондрии посредством прямого взаимодействия белков TDRKH-MIWI. Это согласуется с вышеприведенным наблюдением, что локализация MIWI, но не MILI в IMC была нарушена потерей TDRKH в Tdrkh ^cKO сперматоцитах.

Рисунок 5.

Заякоренная в митохондриях TDRKH рекрутирует MIWI, но не MILI в митохондрии. ( A ) Доменная архитектура TDRKH и ее мутации. TM, трансмембранный домен. Туд, Тюдоровский домен. ( B ) TDRKH прикрепляется к митохондриям через свою трансмембранную область. Клетки HeLa трансфицировали указанными плазмидами, меченными GFP. Через 48 ч трансфицированные клетки окрашивали Mitotracker и затем фиксировали. ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм.( C ) TDRKH рекрутирует MIWI в митохондрии. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами MIWI, меченными GFP, вместе с указанными плазмидами, меченными RFP. Через 48 ч клетки фиксировали и окрашивали ДНК DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( D ) TDRKH не рекрутирует MILI в митохондрии. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами MILI, меченными GFP, вместе с указанными плазмидами, меченными RFP. Через 48 ч клетки фиксировали и окрашивали ДНК DAPI. Масштабная линейка 20 мкм.

Рисунок 5.

Заякоренная в митохондриях TDRKH рекрутирует MIWI, но не MILI в митохондрии. ( A ) Доменная архитектура TDRKH и ее мутации. TM, трансмембранный домен. Туд, Тюдоровский домен. ( B ) TDRKH прикрепляется к митохондриям через свою трансмембранную область. Клетки HeLa трансфицировали указанными плазмидами, меченными GFP. Через 48 ч трансфицированные клетки окрашивали Mitotracker и затем фиксировали. ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм. ( C ) TDRKH рекрутирует MIWI в митохондрии.Клетки HeLa трансфицировали плазмидами MIWI, меченными GFP, вместе с указанными плазмидами, меченными RFP. Через 48 ч клетки фиксировали и окрашивали ДНК DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( D ) TDRKH не рекрутирует MILI в митохондрии. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами MILI, меченными GFP, вместе с указанными плазмидами, меченными RFP. Через 48 ч клетки фиксировали и окрашивали ДНК DAPI. Масштабная линейка 20 мкм.

TDRKH требуется для MIWI, но не для локализации MILI в хроматоидном теле

Фрагментация хроматоидных телец (CB) в круглых сперматидах является распространенным дефектом, связанным с дефицитом piRNA, наблюдаемым у мутантных мышей с дефицитом piRNA (9,20,42).Точно так же мы наблюдали фрагментированные CB в круглых сперматидах Tdrkh ^cKO (рис. 6А). Несмотря на фрагментацию CB, белки пути piRNA MVH и MILI обычно были обогащены в CB в Tdrkh ^cKO круглых сперматидах (фиг. 6B). Однако, в отличие от них, MIWI были полностью лишены концентрации в CB, демонстрируя лишь слабое однородное цитоплазматическое распределение (Рисунок 6B). Неудачная локализация MIWI в CB является уникальной для дефицита TDRKH, потому что MIWI обычно концентрировалась в CB Pnldc1 ^{— / —} и Mov10l1 ^cKO сперматид (рис. 6C), которые демонстрировали в целом аналогичный сниженный уровень экспрессии MIWI. (Дополнительный рисунок S3), уровень piRNA (Дополнительный рисунок S4) и фрагментация CB (Дополнительный рисунок S9) (42).Путем совместного иммуноокрашивания MIWI и MVH мы подтвердили отсутствие MIWI в CB in situ , в то время как нормальное присутствие MVH в CB той же круглой сперматиды Tdrkh ^cKO (фигура 6D). Следовательно, дефицит TDRKH приводит к определенному отсутствию MIWI, но не MILI в CB. Это обеспечивает неожиданное генетическое разделение дифференциальной компартментализации MIWI и MILI, предполагая отдельный механизм локализации CB для этих двух членов PIWI.

Рисунок 6.

Дефицит TDRKH нарушает локализацию MIWI, но не MILI, в хроматоидных телах в круглых сперматидах. ( A ) Дефицит TDRKH вызывает фрагментацию хроматоидных тел в круглых сперматидах. Просвечивающая электронная микроскопия была выполнена на круглых сперматидах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Хроматоидные тела обозначены пунктирной линией и увеличены справа. Масштабные линейки 2 мкм (слева) и 1 мкм (справа). ( B ) Дефицит TDRKH специфически нарушает локализацию MIWI в хроматоидном теле.Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MILI, MVH или MIWI в круглых сперматидах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм. ( C ) PNLDC1 и MOV10L1 не требуются для локализации MIWI в хроматоидном теле. Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MIWI на семенниках взрослых Mov10l1 ^cKO и Pnldc1 ^{— / —} . ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм. ( D ) Потеря TDRKH нарушает локализацию MIWI в хроматоидном теле.Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MIWI и MVH в круглых сперматидах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. ДНК окрашивали DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( E ) TDRKH не локализуется в хроматоидных теле круглых сперматид. Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MVH и TDRKH в круглых сперматидах из семенников взрослых дикорастущих животных. ДНК окрашивали DAPI. Боды хроматоида обозначены белыми стрелками. Шкала 5 мкм.

Рисунок 6.

Дефицит TDRKH нарушает локализацию MIWI, но не MILI, в хроматоидных телах в круглых сперматидах.( A ) Дефицит TDRKH вызывает фрагментацию хроматоидных тел в круглых сперматидах. Просвечивающая электронная микроскопия была выполнена на круглых сперматидах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников. Хроматоидные тела обозначены пунктирной линией и увеличены справа. Масштабные линейки 2 мкм (слева) и 1 мкм (справа). ( B ) Дефицит TDRKH специфически нарушает локализацию MIWI в хроматоидном теле. Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MILI, MVH или MIWI в круглых сперматидах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников.ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм. ( C ) PNLDC1 и MOV10L1 не требуются для локализации MIWI в хроматоидном теле. Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MIWI на семенниках взрослых Mov10l1 ^cKO и Pnldc1 ^{— / —} . ДНК окрашивали DAPI. Шкала 10 мкм. ( D ) Потеря TDRKH нарушает локализацию MIWI в хроматоидном теле. Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MIWI и MVH в круглых сперматидах взрослых WT и Tdrkh ^cKO семенников.ДНК окрашивали DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( E ) TDRKH не локализуется в хроматоидных теле круглых сперматид. Иммуноокрашивание проводили с использованием антител MVH и TDRKH в круглых сперматидах из семенников взрослых дикорастущих животных. ДНК окрашивали DAPI. Боды хроматоида обозначены белыми стрелками. Шкала 5 мкм.

В круглых сперматидах дикого типа TDRKH демонстрирует митохондриальную локализацию и явно не локализован в CB, поскольку совместное окрашивание TDRKH и MVH (концентрированный CB) показало полный неперекрывающийся паттерн экспрессии (рис. 6E).Это указывает на то, что TDRKH физически отделен от компонентов CB, включая его партнера по связыванию MIWI, несмотря на их совместную экспрессию в круглых сперматидах. Это, в свою очередь, указывает на то, что TDRKH не регулирует локализацию MIWI в круглых сперматидах. В совокупности наши результаты показывают, что потеря MIWI в CB Tdrkh ^cKO круглых сперматид является результатом отказа от привлечения MIWI к IMC в сперматоцитах Tdrkh ^cKO .

Отсутствие MIWI в CB сопровождается дефектным молчанием транспозонов в круглых сперматидах

Затем мы исследовали функциональные последствия истощения MIWI (вместе с ассоциированными piRNAs) из CB, исследуя экспрессию ретротранспозона в сперматидах Tdrkh ^cKO .Было установлено, что MIWI является единственным белком PIWI, необходимым для подавления LINE1 в круглых сперматидах, в то время как MIWI и MILI необходимы для подавления LINE1 в сперматоцитах (8,9). В качестве положительного контроля мы наблюдали дерепрессию LINE1 в сперматоцитах Miwi ^{— / —} и круглых сперматидах (рис. 7). Подобно паттерну в Miwi ^{— / —} , ORF1 LINE1 был повышен в цитоплазме сперматоцитов Tdrkh ^cKO и ядер Tdrkh ^cKO круглых сперматид (фигура 7).Дерепрессия LINE1 ORF1 в Tdrkh ^cKO круглых сперматидах, вероятно, является результатом истощения MIWI в CB, а не потери TDRKH в круглых сперматидах. Это связано с тем, что TDRKH не может подавлять только LINE1, что очевидно из активации LINE1 в сперматидах Miwi ^{— / —} , которые демонстрируют нормальную экспрессию и локализацию TDRKH (дополнительный рисунок S10A).

Рисунок 7.

Отсутствие MIWI в хроматоидном теле сопровождается дерепрессией LINE1 в круглых сперматидах.Иммуноокрашивание проводили с использованием антитела LINE1 ORF1 на семенниках взрослых WT, Tdrkh ^cKO, Miwi ^{— / —}, Pnldc1 ^{— / —} и Mov10l1 ^cKO . ДНК окрашивали DAPI. Круглые сперматиды обозначены белыми стрелками. Сперматоциты пахитены обозначены желтыми стрелками. Увеличенные изображения показаны на правой панели.

Рис. 7.

В яичках Mov10l1 ^cKO , в которых piRNAs в основном истощены, но сохраняется нормальная локализация CB MIWI, LINE1 должным образом подавлялся как в сперматоцитах, так и в круглых сперматидах, что указывает на то, что большая часть piRNA не требуется для репрессии LINE1 во взрослых семенниках. (42) (Рисунок 7).Это, в свою очередь, указывает на то, что сам белок MIWI, но не MIWI-piRNAs, являются критическими для сайленсинга LINE1 в круглых сперматидах. В семенниках Pnldc1 ^{— / —} LINE1 активируется в сперматоцитах, но не в круглых сперматидах, что указывает на то, что созревание длины piRNA не требуется для репрессии LINE1 в круглых сперматидах (22) (Рисунок 7). Вместе эти данные подтверждают важность локализации MIWI CB в регуляции молчания транспозонов в сперматидах, и эта функция, вероятно, не зависит от piRNA.

TDRKH связывает триммер piRNA PNLDC1 с митохондриями

TDRKH и PNLDC1 тесно связаны в триммерном комплексе piRNA, а триммерная активность PNLDC1 требует его партнера с TDRKH (31). Поскольку PNLDC1 имеет предполагаемый C-терминальный трансмембранный мотив, мы предположили, что PNLDC1, подобно TDRKH, самолокализируется на митохондриальной мембране. Чтобы проверить эту гипотезу, мы экспрессировали GFP- или Flag-tagged PNLDC1 в клетках HeLa и проанализировали его потенциальную митохондриальную локализацию путем совместного окрашивания с помощью митотрекера.Интересно, что PNLDC1 в основном диффундировал в цитоплазму и лишь незначительно локализовался в митохондриях (рисунок 8A и дополнительный рисунок S11). Это указывает на то, что PNLDC1 имеет ограниченную способность к локализации в митохондриях в тестируемой системе клеток HeLa. Поразительно, что при совместной экспрессии с TDRKH заякоренная в митохондриях TDRKH была способна резко рекрутировать и обогащать PNLDC1 на митохондриях (Рисунок 8B). В соответствии с этим PNLDC1 не требуется для митохондриальной локализации TDRKH, поскольку уровни белка TDRKH и митохондриальная локализация не были нарушены в сперматоцитах Pnldc1 ^{— / —} (дополнительный рисунок S10B).Эти результаты указывают на то, что заякоренная в митохондриях TDRKH может рекрутировать как PNLDC1, так и MIWI в митохондрии, и настоятельно предполагают, что TDRKH в сперматоцитах играет ключевую роль в формировании и функции триммингового комплекса piRNA в IMC.

Рисунок 8.

TDRKH связывает триммер PNLDC1 с митохондриями и предлагаемую модель функции TDRKH. ( A ) Совместная флуоресценция PNLDC1 с Mitotracker. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами PNLDC1, меченными GFP.Через 48 ч трансфицированные клетки окрашивали Mitotracker и фиксировали. ДНК окрашивали DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( B ) TDRKH рекрутирует PNLDC1 в митохондрии. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами PNLDC1, меченными GFP, вместе с указанными плазмидами, меченными RFP. Через 48 часов клетки фиксировали и окрашивали ДНК DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( C ) Предложенная модель, иллюстрирующая роль TDRKH в биогенезе пахитен-пиРНК и развитии зародышевых клеток. TDRKH специально набирает MIWI в IMC, а неизвестный белок закрепляет MILI в IMC.После загрузки промежуточных продуктов piRNA в MIWI и MILI, TDRKH связывает триммер PNLDC1 для обрезки промежуточных продуктов piRNA до конечной длины. Комплексы MIWI- и MILI-piRNA в основном существуют в хроматоидном теле круглых сперматид. MIWI подавляет экспрессию LINE1 в хроматоидном теле, вероятно, за счет своей срезной активности не зависимым от piRNA образом. MILI и связанных с ним piRNAs недостаточно, чтобы заставить замолчать LINE1 в круглых сперматидах.

Рисунок 8.

TDRKH связывает триммер PNLDC1 с митохондриями и предлагаемую модель функции TDRKH.( A ) Совместная флуоресценция PNLDC1 с Mitotracker. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами PNLDC1, меченными GFP. Через 48 ч трансфицированные клетки окрашивали Mitotracker и фиксировали. ДНК окрашивали DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( B ) TDRKH рекрутирует PNLDC1 в митохондрии. Клетки HeLa трансфицировали плазмидами PNLDC1, меченными GFP, вместе с указанными плазмидами, меченными RFP. Через 48 часов клетки фиксировали и окрашивали ДНК DAPI. Масштабная линейка 20 мкм. ( C ) Предложенная модель, иллюстрирующая роль TDRKH в биогенезе пахитен-пиРНК и развитии зародышевых клеток.TDRKH специально набирает MIWI в IMC, а неизвестный белок закрепляет MILI в IMC. После загрузки промежуточных продуктов piRNA в MIWI и MILI, TDRKH связывает триммер PNLDC1 для обрезки промежуточных продуктов piRNA до конечной длины. Комплексы MIWI- и MILI-piRNA в основном существуют в хроматоидном теле круглых сперматид. MIWI подавляет экспрессию LINE1 в хроматоидном теле, вероятно, за счет своей срезной активности не зависимым от piRNA образом. MILI и связанных с ним piRNAs недостаточно, чтобы заставить замолчать LINE1 в круглых сперматидах.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы демонстрируем, что TDRKH действует как ключевой скаффолдный белок, закрепленный в митохондриях, который специфически рекрутирует MIWI в IMC и связывает PNLDC1, чтобы соединить два ключевых этапа биогенеза piRNA во время биогенеза pachytene piRNA: рекрутирование MIWI и обрезка piRNA. Эта TDRKH-опосредованная функция каркаса важна для продукции MIWI-piRNA, локализации MIWI CB, подавления транспозонов и спермиогенеза. Открытие TDRKH-зависимой пространственной сегрегации MIWI и MILI в IMC обеспечивает молекулярную основу для понимания функциональных различий между MIWI и MILI в подавлении транспозонов и развитии мейотических и постмейотических зародышевых клеток.

Разные механизмы митохондриальной локализации для MIWI и MILI

Одним из ключевых открытий в этом исследовании является пространственная сегрегация MIWI и MILI при потере митохондриальных локализованных TDRKH в мужских половых клетках. В сперматоцитах с дефицитом TDRKH MIWI распространяется, в то время как MILI остается обогащенным в IMC. TDRKH прочно ассоциируется с MIWI, но в меньшей степени с MILI (30,36). Наши исследования in vivo, и in vitro, демонстрируют, что TDRKH одновременно необходим и достаточен для участия MIWI в пути биогенеза piRNA.Однако TDRKH не требуется для набора MILI в IMC. Самым простым объяснением этого является то, что вход MILI в IMC опосредуется другим белком, скорее всего, другим белком, заякоренным в митохондриях (рис. 8C). Идентичность предполагаемого MILI-специфичного связывающего белка требует дальнейшего изучения.

Первоначальное привлечение MIWI с помощью TDRKH наиболее вероятно в нативной форме без связанных piRNAs. Это подтверждается способностью TDRKH обогащать MIWI без piRNA на митохондриях в эксперименте по коэкспрессии клеток HeLa (рис. 5).Основываясь на наших данных, привлечение MIWI с помощью TDRKH может быть первым шагом к обогащению MIWI на митохондриальной поверхности, подготовке MIWI к связыванию, загрузке и обрезке предшественников piRNA. TDRKH-опосредованное дифференциальное рекрутирование MIWI и MILI обеспечивает уникальную отправную точку для дальнейшего анализа сложного механизма процессинга piRNA в IMC и функциональных различий MIWI и MILI, которые оба важны для биогенеза piRNA и сперматогенеза.

Функция каркаса TDRKH связывает рекрутирование MIWI с обрезкой piRNA

TDRKH — это локализованный в митохондриях белок, прочно связанный с PNLDC1, чтобы регулировать обрезку piRNA в IMC (30,31).Хотя и TDRKH, и PNLDC1 содержат предполагаемые трансмембранные области, мы обнаружили, что TDRKH обладает способностью самонацеливаться на митохондриальную мембрану при трансфекции в культивируемых клетках. Трансмембранный регион необходим для его митохондриальной локализации. Напротив, PNLDC1 имеет только слабый потенциал митохондриальной локализации, но он сильно обогащается в митохондриях, когда коэкспрессируется с TDRKH (Figure 8). Это указывает на то, что TDRKH является ключевым заякоренным в митохондриях белком, который стыкуется с PNLDC1 и MIWI для сборки комплекса обрезки piRNA для созревания piRNA 3 ‘.Это частично объясняет, почему триммерная активность PNLDC1 постоянно зависит от присутствия TDRKH in vitro и in vivo (22,30,31).

Несмотря на неспособность TDRKH рекрутировать MILI в митохондрии, обрезка MILI-связанных пре-пиРНК все еще требует TDRKH. Это указывает на то, что тримминговый комплекс PNLDC1 / TDRKH доступен для MILI, связанной с пре-пиРНК. PNLDC1 может проявлять тримминговую активность посредством прямого связывания с белками PIWI, нагруженными piRNA, после образования комплекса с TDRKH в IMC.Действительно, PNLDC1 взаимодействует со всеми белками PIWI (MIWI, MILI и MIWI2) в системе in vitro (дополнительный рисунок S12). Прямое влияние TDRKH на локализацию белка MIWI и продукцию MIWI-piRNA может объяснить, почему мыши Tdrkh ^cKO имеют более серьезный арест зародышевых клеток, чем мыши Pnldc1 ^{— / —} . Таким образом, заякоренный в митохондриях белковый комплекс TDRKH не только обеспечивает обрезку piRNA, но также включает начальное рекрутирование MIWI, не содержащего piRNA, в IMC, связывая два важных этапа процессинга piRNA.

Понимание образования хроматоидных тел млекопитающих и подавления транспозонов в сперматидах

Хотя MIWI и MILI оба присутствуют в CB круглых сперматид, только MIWI необходим для сайленсинга LINE1 (8,9). Это молчание зависит от срезной активности MIWI (9), но считается независимым от piRNA (42). Это связано с тем, что у Mov10l1 ^cKO мышей с MIWI, обедненным piRNA в CB, LINE1 все еще должным образом замалчивается (42). Наши данные показывают, что дефицит TDRKH вызывает избирательную потерю MIWI из CB, и это коррелирует с дерепрессией LINE1 в круглых сперматидах, предполагая, что резиденция MIWI CB необходима для репрессии LINE1.Это, в свою очередь, подтверждает критическую роль CB в подавлении транспозонов. Образование предшественника CB в сперматоцитах было связано с комплексами PIWI-piRNA, полученными из IMC (21). Мы предполагаем, что нацеливание MIWI CB регулируется начальным взаимодействием MIWI-TDRKH в IMC в пахитеновых сперматоцитах, что является предпосылкой для проживания MIWI в CB круглых сперматид. Требование TDRKH для сайленсинга LINE1 круглых сперматид может быть опосредовано его потребностью в локализации MIWI в CB. Мы предполагаем, что MIWI проявляет свою активность среза в CB, чтобы заглушить экспрессию LINE1.Этот независимый от piRNA механизм лежит в основе потребности в различных механизмах сайленсинга в разных типах зародышевых клеток для защиты генома зародышевой линии от транспозонов во время множественных стадий сперматогенеза.

Определенные митохондриальные белковые комплексы каркаса TDRKH у разных видов

У Drosophila среди трех членов семейства PIWI (Piwi, Aub и Ago3) TDRKH / Papi специфически взаимодействует с ядерным Piwi, но не с цитоплазматическими Aub и Ago3 (34).В отличие от мышей и тутового шелкопряда, гомолог PNLDC1 / trimmer не существует у Drosophila (дополнительный рисунок S13). Однако TDRKH / Papi необходим для обрезки Piwi-piRNA, несмотря на отсутствие PNLDC1 / Trimmer (32). Механизм, с помощью которого TDRKH контролирует обрезку Piwi-piRNA у Drosophila , остается неизвестным. У шелкопряда TDRKH / Papi взаимодействует с обоими цитоплазматическими белками PIWI, Siwi и Ago3, и необходим для обрезки их 3′-концов piRNA за счет партнерства с PNLDC1 / Trimmer (31,44).Это отличается от предпочтения каркасов TDRKH / Papi у мышей, где TDRKH предпочтительно связывает MIWI, но не MILI, и генетически разделяет эти два сходных белка PIWI во время биогенеза piRNA. У Drosophila и тутового шелкопряда TDRKH / Papi распознает только белки PIWI, метилированные аргинином (34,35,44,45). У мышей, однако, TDRKH взаимодействует с MIWI независимо от метилирования аргинина (33). Вместе эти исследования показывают, что, хотя TDRKH / Papi является каркасным белком, обычно необходимым для обрезки piRNA у разных видов, молекулярные механизмы, с помощью которых TDRKH / Papi взаимодействует с белками PIWI и ферментами, выравнивающими piRNA, чтобы участвовать в пути piRNA, варьируются у разных видов.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Все данные секвенирования депонированы в архиве считывания последовательностей NCBI под регистрационным номером SRP155835.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Джейсона Нотта и Сяои Ченга за критическое прочтение рукописи, Джорджа Смита, Цзянь Ху и Джима Айрлэнд за совместное использование оборудования.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Китайский стипендиальный совет [201406355022 Дж.L.]; Фонды AgBioResearch МГУ [в C.C.]; Национальные институты здравоохранения (NIH) [R01HD075903 к K.E.L и R01HD084494 к C.C.]. Финансирование платы за открытый доступ: NIH.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Аравин

А.А.

Наумова

Н.М.

Тулин

А.В.

Вагин

В.В.

Розовский

Ю.М.

Гвоздев

В.A.

Двухцепочечная РНК-опосредованное подавление геномных тандемных повторов и мобильных элементов в зародышевой линии D. melanogaster

Curr. Биол .: CB

2001

;

1017

—

1027

.2.

Аравин

А.

Гайдацис

Д.

Пфеффер

С.

Лагос-Кинтана

М.

Ландграф

П.

Н.,

Morris

Brownstein

M.J.

Kuramochi-Miyagawa

Nakano

et al. .

Новый класс малых РНК связывается с белком MILI в семенниках мыши

Природа

2006

;

442

203

—

207

.3.

Girard

Sachidanandam

Hannon

G.J.

Carmell

M.A.

Класс малых РНК, специфичных для зародышевой линии, связывает белки Piwi

млекопитающих.

Природа

2006

;

442

199

—

202

.4.

Гривна

S.T.

Beyret

Wang

Lin

Новый класс малых РНК в сперматогенных клетках мышей

Genes Dev.

2006

;

1709

—

1714

. 5.

Мэлоун

C.D.

Hannon

G.J.

Малые РНК как хранители генома

Ячейка

2009

;

136

656

—

668

.6.

Lau

N.C.

Seto

Kim

Kuramochi-Miyagawa

Nakano

Бартель

Д.П.

Kingston

R.E.

Характеристика комплекса piRNA из семенников крысы

Наука

2006

;

313

363

—

367

.7.

Siomi

M.C.

Sato

Pezic

Aravin

A.A.

Малые РНК, взаимодействующие с PIWI: авангард защиты генома

Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

2011

;

246

—

258

.8.

Di Giacomo

Comazzetto

Saini

De Fazio

Carrieri

M. Morgan ,

Василяускайте

Benes

Enright

О’Кэрролл

Д.

Множественные эпигенетические механизмы и путь piRNA усиливают молчание LINE1 во время сперматогенеза взрослых

Мол. Ячейка

2013

;

601

—

608

.9.

Reuter

Berninger

Chuma

Shah

Hosokawa

Funaya

C. Энтони

К.

Sachidanandam

Pillai

R.S.

Катализ Miwi необходим для независимого от амплификации piRNA подавления транспозона LINE1

Природа

2011

;

480

264

—

267

.10.

Brennecke

Aravin

A.A.

Stark

Dus

Kellis

Sachidanandam

Hannon

G.J.

Дискретные локусы, генерирующие малую РНК, как главные регуляторы активности транспозонов у Drosophila

Ячейка

2007

;

128

1089

—

1103

.11.

Аравин

А.А.

Sachidanandam

Bourc’his

Schaefer

Pezic

Toth

K.F.

Bestor

Hannon

G.J.

Путь пиРНК, примированный отдельными транспозонами, связан с метилированием ДНК de novo у мышей

Мол. Ячейка

2008

;

785

—

799

.12.

De Fazio

Bartonicek

Di Giacomo

Abreu-Goodger

Санкар

Funaya

Antony

Moreira

P.N.

Enright

A.J.

O’Carroll

Эндонуклеазная активность Mili способствует амплификации пиРНК, которая подавляет элементы LINE1

Природа

2011

;

480

259

—

263

. 13.

Ивасаки

Ю.W.

Siomi

M.C.

Siomi

PIWI-взаимодействующая РНК: ее биогенез и функции

Annu. Rev. Biochem.

2015

;

405

—

433

. 14.

Kuramochi-Miyagawa

Watanabe

Gotoh

Totoki

Toyoda

kawa

Asada

Kojima

Yamaguchi

Ijiri

T.W.

et al. .

ДНК-метилирование генов ретротранспозонов регулируется членами семейства Piwi MILI и MIWI2 в семенниках плода мыши

Genes Dev.

2008

;

908

—

917

. 15.

Vourekas

Zheng

Alexiou

Maragkakis

Kirino

Gregory

B.D.

Mourelatos

Репертуар РНК-мишеней Mili и Miwi раскрывает биогенез пиРНК и функцию Miwi в спермиогенезе

Nat. Struct. Мол. Биол.

2012

;

773

—

781

. 16.

Gou

L.T.

Dai

Yang

J.H.

Xue

Y.P.

Zhou

Kang

J.Y.

Wang

Hua

M.M.

et al. .

Pachytene piRNAs инструктируют массивную элиминацию мРНК во время позднего спермиогенеза

Cell Res.

2014

;

680

—

700

. 17.

Ватанабе

Т.

Cheng

E.C.

Zhong

Lin

Ретротранспозоны и псевдогены регулируют мРНК и днРНК через путь piRNA в зародышевой линии

Genome Res.

2015

;

368

—

380

0,18.

Wang

P.J.

ПиРНК млекопитающих: биогенез, функция и загадки

Сперматогенез

2014

;

e27889

.19.

Аравин

А.А.

van der Heijden

G.W.

Кастанеда

Дж.

Вагин

В.В.

Hannon

G.J.

Бортвин

Цитоплазматическая компартментализация пути пиРНК плода у мышей

PLos Genet.

2009

;

e1000764

.20.

Yabuta

Ohta

Abe

Kurimoto

Chuma

TDRD5 необходим для подавления ретротранспозона, сборки хроматоидных телец и спермиогенеза у мышей

J. Cell Biol.

2011

;

192

781

—

795

. 21.

Лехтиниеми

Т.

Kotaja

Регуляция РНК, опосредованная зародышевыми гранулами, в мужских половых клетках

Репродукция

2018

;

155

R77

—

R91

.22.

Ding

Liu

Dong

Midic

Hess

R.A.

Се

Х.

Демирева

Е.Ю.

Chen

PNLDC1 необходим для обрезки 3′-концов piRNA и подавления транспозонов во время сперматогенеза у мышей

Nat. Commun.

2017

;

819

. 23.

Nishimura

Nagamori

Nakatani

Izumi

Tomari

chi 9 -0004 Miyawa S.

Nakano

PNLDC1, мышиный триммер пре-пиРНК, необходим для развития мейотических и постмейотических мужских половых клеток

Представитель EMBO

2018

;

e44957

. 24.

Zhang

Guo

Cui

Zhu

Zhang

000

Wu 9000 Чжэн

Б.

Yue

Bai

Zeng

et al. .

Важная роль PNLDC1 в обрезке 3′-концов piRNA и фертильности самцов у мышей

Cell Res.

2017

;

1392

—

1396

. 25.

Kirino

Mourelatos

Гомолог HEN1 мыши является потенциальной метилазой для Piwi-взаимодействующих РНК

РНК

2007

;

1397

—

1401

. 26.

Kirino

Mourelatos

РНК, взаимодействующие с Piwi мыши, 2′-O-метилированы на своих 3′-концах

Nat. Struct. Мол. Биол.

2007

;

347

—

348

0,27.

Deng

Lin

miwi, мышиный гомолог piwi, кодирует цитоплазматический белок, необходимый для сперматогенеза

Dev. Ячейка

2002

;

819

—

830

. 28.

Курамоти-Миягава

Kimura

Ijiri

T.W.

Isobe

Asada

Fujita

Ikawa

Iwai

Okabe

Дэн

Вт.

et al. .

Mili, представитель гена семейства piwi у млекопитающих, необходим для сперматогенеза

Развитие

2004

;

131

839

—

849

. 29.

Ding

Liu

Midic

Dong

Melnick A.

Latham

Чен

С.

TDRD5 связывает предшественники пиРНК и избирательно усиливает процессинг пиРНК пахитена у мышей

Nat. Commun.

2018

;

127

.30.

Saxe

J.P.

Chen

Zhao

Lin

Tdrkh важен для сперматогенеза и участвует в первичном зародышевом процессе 9000 piRNA.

EMBO J.

2013

;

1869

—

1885

.31.

Izumi

Shoji

Sakaguchi

Honda

Kirino

Suzuki T.

000 ,

Katsuma

Tomari

Идентификация и функциональный анализ 3 ‘триммера пре-пиРНК у тутовых шелкопрядов

Ячейка

2016

;

164

962

—

973

.32.

Hayashi

Schnabl

Handler

Mohn

Ameres

S.L.

Brennecke

Генетическое и механистическое разнообразие образования 3′-конца пиРНК

Природа

2016

;

539

588

—

592

. 33.

Чжан

Х.

Лю

К.

Izumi

Huang

Ding

Sidhu

Chen

C. Tomari

Min

Структурная основа для независимого от метилирования аргинина распознавания PIWIL1 с помощью TDRD2

PNAS

2017

;

114

12483

—

12488

.34.

Zhang

Liu

Peng

Huang

Структурное понимание специфического для последовательности распознавания Piwi Drosophila Papi

PNAS

2018

;

115

3374

—

3379

0,35.

Нисида

К.М.

Sakakibara

Iwasaki

Y.W.

Yamada

Murakami

Murota

Kawamura

Kodama

Сиоми

Иерархические роли митохондриальных папи и цуккини в биогенезе piRNA зародышевой линии Bombyx

Природа

2018

;

555

260

—

264

0,36.

Чен

К.

Джин

Дж.

Джеймс

Д.А.

Адамс-Чиоаба

M.A.

Park

J.G.

Guo

Tenaglia

Gish

Min

et al..

Мышиный интерактом Piwi идентифицирует механизм связывания Tdrkh Tudor домена с аргинином, метилированным Miwi

PNAS

2009

;

106

20336

—

20341

0,37.

Вагин

В.В.

Wohlschlegel

Jonsson

Huang

Chuma

Girard A.

Sachidanandam

Hannon

G.J.

Аравин

А.А.

Протеомный анализ белков Piwi мышей показывает роль метилирования аргинина в определении взаимодействия с членами семейства Tudor

Genes Dev.

2009

;

1749

—

1762

0,38.

Фрост

R.J.

Hamra

F.K.

Ричардсон

Дж.A.

Bassel-Duby

Olson

E.N.

MOV10L1 необходим для защиты сперматоцитов от ретротранспозонов посредством Piwi-взаимодействующих РНК

PNAS

2010

;

107

11847

—

11852

. 39.

Sadate-Ngatchou

P.I.

Payne

C.J.

Dearth

A.T.

Браун

р.E.

Cre-рекомбиназная активность, специфичная для постнатальных премейотических мужских половых клеток у трансгенных мышей

Бытие

2008

;

738

—

742

.40.

Vourekas

Zheng

Maragkakis

Alexiou

Ma Пиллаи

р.S.

Mourelatos

Wang

P.J.

РНК-геликаза MOV10L1 связывает предшественники пиРНК, чтобы инициировать процессинг пиРНК

Genes Dev.

2015

;

617

—

629

.41.

Фрост

R.J.A.

Hamra

F.K.

Ричардсон

Дж. А.

Ци

X.X.

Bassel-Duby

р.

Олсон

E.N.

MOV10L1 необходим для защиты сперматоцитов от ретротранспозонов посредством Piwi-взаимодействующих РНК

PNAS

2010

;

107

11847

—

11852

.42.

Zheng

Wang

P.J.

Блокада биогенеза pachytene piRNA выявляет новую потребность в поддержании целостности постмейотического генома зародышевой линии

PLos Genet.

2012

;

e1003038

.43.

Zheng

Xiol

Reuter

Eckardt

Leu

N.A.

McLaughlin

Stark

Sachidanandam

Pillai

R.S.

Wang

P.J.

MOV10L1 мыши ассоциируется с белками Piwi и является важным компонентом пути

взаимодействующей с Piwi РНК (piRNA).

PNAS

2010

;

107

11841

—

11846

. 44.

Honda

Kirino

Maragkakis

Alexiou

Ohtaki

Murali Mourelatos

Kirino

Митохондриальный белок BmPAPI модулирует длину зрелых пиРНК

РНК

2013

;

1405

—

1418

. 45.

Liu

Wang

Lin

PAPI, новый белок TUDOR-домена, комплексы с AGO3, ME31B и TRAL в nuage, чтобы заглушить транспозицию

Развитие

2011

;

138

1863

—

1873

Заметки автора

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

miwi — Лигапедия | Лига легенд киберспорта вики

Из Лигпедии | Лига Легенд Киберспорт Вики

Джозеф Ву Страна рождения

Пенсионер
miwi

Справочная информация
Имя	Джозеф Ву		США Страна рождения
NA Северная Америка
Конкурентоспособная
Роль	Поддержка
Любимые чемпионы
	mi	nwe Jdwu, jdwü, jdnoob, jdwut, mMe jdwu, NOTORIOUS biGG
Социальные сети и ссылки

Джозеф « miwi » Ву — бывший киберспортсмен League of Legends , ранее поддерживавший New World Eclipse.Ранее он был известен как jdwu .

История команды

Комбинация смены ролей: Нет | Да

Даты: Приблизительно | Точно

Новости

NA	⁠⁠MMU	июнь (приблизительно), jdwu, 1onz и Arthelon присоединяются. e
NA	⁠⁠MMU	сентябрь (приблизительно), Next, jdwu, Jintae, Chow и 1onz уезжают. e
NA	⁠⁠4N	20 сентября, jdwu присоединяется. e
NA	⁠⁠4N	5 ноября ⁠⁠TEAM4NOT.NA распускается. jdwu, PR0LLY, paroL, iNoobish и Dan Dinh (тренер) уходят. ^[1] e
NA	⁠⁠DNG	4 декабря ⁠⁠Dirt Nap Gaming преобразована под названием Dirt Nap Gaming Eternus . Присоединяются Cris, jdwu, PR0LLY, ecko и Prophet. dx30 подключается как замена.^[3] e

NA	⁠⁠DNG	8 февраля Jdwu уходит. ^[2] e
NA	⁠⁠FXO	8 февраля, jdwu присоединяется. ^[4] e
NA	⁠⁠FXO	25 февраля, Тед Стиклз присоединяется. jdwu уходит. e
NA	⁠⁠NWE	май (прибл.), ⁠⁠Сформирован новый мир Eclipse. Присоединяются Quas, Jdwu, Shao, otter и Huang. Jdwu переименовывает в miwi. e
NA	⁠⁠NWE	июль (прибл.), npromsiri и cat8 присоединяются. miwi (Джунгли на Поддержку) меняет позицию. Вирус и Хуанг уходят. e
NA	⁠⁠NWE	Сентябрь (приблизительно), ⁠⁠New World Eclipse распущен. Quas, npromsiri, Shao, Meruem и miwi уходят. е

Биография [править]

Результаты турнира

[править]

В этой таблице показаны до 10 последних результатов. Для получения полных результатов щелкните здесь.

9028

Результаты турнира Miwi
Дата	Pl	Событие	Последний результат	Team	Состав
2013-09-09	MOBI : W⁠⁠COG	⁠⁠NWE	Quas, npromsiri, Shao, Meruem, miwi
2013-09-01	3-4	NA LCS 2014 Spring Prequalifier PAX	0: 2 ⁠⁠COG	⁠⁠NWE	Quas, npromsiri, Shao, Meruem, miwi
2013-08-18	5-6	NESL Pro Series Season 7	0: 2⁠⁠TBD	⁠⁠NWE	Quas, npromsiri, Shao, Meruem, miwi
2013-08-11	4	ggLA Challenger Arena # 2	1: 2⁠⁠COG	Quas, npromsiri, Shao, Meruem, miwi
2013-06-08	4	NESL Pro Series Season 6	FF: W⁠⁠CA	⁠⁠NWE	Quas, Jdwu ter, Shao, ot
2013-02-24	5-6	SoloMid IPL6 Qualifier	0: 2 ⁠⁠CA	⁠⁠FXO	Westrice, jdwu , Salce, JRT,	in -02-03	3	CLG Premier Series	1: 2⁠⁠CA	⁠⁠DNG	Cris, jdwu , pr0lly, frommaplestreet, Pixel
9400 30-01-30 1	Rising Stars Invitational 3	2: 0⁠⁠PS	⁠⁠DNG	Cris, jdwu , PR0LLY, frommaplestreet, Pixel
2013-01-23	1	Rising Stars	2: 0 PS	⁠⁠DNG	Cris, jdwu , PR0LLY, frommaplestreet, 울지마
2013-01-18	2	Rising Stars Invitational 1	0: 2⁠⁠C9	⁠⁠DNG	Cris, jdwu, PR0LLY, Nientonsoh, frommaplestreet

Изображения [редактировать]

Перенаправляет

Следующие страницы перенаправляются сюда:

Ссылки

MiWi La Lupa — Team Love Records

Биография

Если вы когда-нибудь были в отеле St Dymphna’s на улице St Marks в Ист-Виллидж в воскресенье вечером, то, возможно, вы бывали на живом выступлении MiWi La Lupa.Обычно он играет с барного стула, в шляпе, шарфе и гитаре. Это было после лет в Буффало и после выпуска его дебютного альбома New Way Home, (Team Love, 2014). В течение 2014 и 2015 годов MiWi давал стабильные концерты в St. Dymphna’s (завсегдатаи известного как Church ), пока он писал песни для своего второго альбома Ended Up Making Love.

Но давайте вернемся немного назад; последнее десятилетие заслуживает краткого обзора.

Первым инструментом MiWi, выросшим в Буффало, был тромбон.Его исследование привело его из Буффало в Рочестер и в музыкальную школу Истмана, где он обменял свой тромбон на басовую трубу, прежде чем, как и многие музыканты, он продолжил путь на юг, прибыв в Нью-Йорк летом 2005 года. для MiWi дела стали ускоряться. Вскоре он обнаружил, что выступает с такими великими людьми, как Лес Макканн, Дэвид Бирн, Билл Фризелл, Феми Кути, Чарли Хантер и Эл-Пи. MiWi также станет одним из первых участников группы Red Baraat, с которой он отправится в мировое турне.

Где-то там, среди всей суеты, MiWi начал писать песни. Первый альбом вышел быстрым и тяжелым, но следующая партия песен, даже после одного прослушивания, является величайшим моментом для MiWi.

Наведение порядка в новых песнях и поиск места для записи привело к странному повороту для MiWi, или, может быть, поскольку природа беспокойной души состоит в том, чтобы продолжать двигаться, это было вовсе не так уж странно. MiWi привлек продюсера Майка Могиса и фронтмена Bright Eyes Конора Оберста для совместного продюсирования альбома в Омахе, в результате чего MiWi собрал чемоданы и переехал на Средний Запад.Теперь это его новый дом.

из Буффало в Бруклин, из Бруклина в Омаху…

New Way Home ознаменовался приходом MiWi в качестве сольного исполнителя. Закончилось Заниматься любовью теперь видит, как его сознание и мелодия растут. Здесь еще что-то происходит. В то время как New Way Home в значительной степени был документальным подтверждением разрыва отношений и последовавшего за этим творческого возрождения, Ended Up Making Love — это сборник песен, которые проливают свет. Есть политическое ( Two Hearts, I Yield ) и личное ( Raincheck, Buffalo Folk ), а есть песни, которые представляют собой поп-жемчужины с пряностями ( Ended Up Making Love, Vines ).

У MiWi многое намечено на 2016 год: помимо нового альбома, весной его ждут микс-кассета, тур по Европе и Великобритании, его роль в новом клубе Долорес Диас из Омахи и The Standby Club. , готовится к летнему тур по США, а вскоре появится еще один альбом.

Ended Up Making Love выйдет 25 марта 2016 года на лейбле Team Love Records.