Услуги оператора МТС. Описание базовых услуг мобильного оператора.

Есть ряд услуг, которые предоставляются абонентам по умолчанию, и входят в базовый набор сервисов стартового пакета. Они не требуют дополнительной настройки и активации и предоставляются почти во всех тарифных планах. Среди списка таких сервисов сотового оператора МТС есть и услуга «определитель номера».

Она позволяет увидеть на дисплее мобильного телефона номер звонящего абонента. Стоимость пользования такой услугой определяется тарифным планом, в котором находится абонент. Стоит обратить внимание на то, что номера других мобильных операторов и городские номера не всегда могут быть определены.

Также сервис не срабатывает, если абонент пользуется услугой «Антиопределитель номера», вместо номера абонента на дисплее будет высвечена надпись «номер скрыт». Это очень удобно, когда в телефоне сохраняются номера пропущенных вызовов, на которые впоследствии будет возможность перезвонить.

Т

акже этот сервис содействует с услугой МТС Гудок, поскольку установленная мелодия на абонента будет проигрываться только в том случае, когда его номер будет определяться.

Как подключить «Определитель номера» на МТС

Решить эту задачу можно несколькими способами. Самый простой способ это отправить USSD запрос с мобильного телефона, для этого нужно на телефоне набрать комбинацию *111*44# и нажать кнопку вызова.

Второй способ это отправить СМС сообщение с текстом 2113 на номер 111. Один из самых простых способов, подойдет для тех абонентов, которые не могут отправить USSD запрос со своего мобильного устройства.

Также данную услугу можно подключить при помощи интернет помощника. Для этого абонент должен перейти по адресу https://ihelper.mts.ru/selfcare/?home . Далее войти в свой аккаунт или зарегистрироваться, в том случае если он впервые пользуется системой самообслуживания абонентов.

Далее среди списка предоставляемых услуг оператором выбрать «Определитель номера» и активировать ее.

• Если у пользователя возникну вопросы по работе услуги и ее предоставлению абонентам, то получить ответ на интересующий вопрос можно в службе технической поддержки абонентов МТС. Для этого нужно позвонить по номеру 8 800 250 0890. {jcomments on}

Как узнать скрытый номер на МТС, Билайн, Мегафон и Теле2

После подключения услуги на номере любого оператора можно не переживать, что на экране во время звонка будет отображаться скрытый номер. Однако, все операторы предупреждают, что услуга не гарантирует стопроцентное отображение скрытых номеров. Так, точно проверить отображаемый номер, который скрытый пользователем, можно только если он принадлежит вашему оператору, и находится в одном регионе.

Как проверить неизвестные номера

Неудобства пользователям приносят не только скрытые, но и просто неизвестные номера телефона. Особенно это касается пропущенных звонков. Единого решения от операторов, и даже на платной основе, не существует.

Сегодня операторы не имею права раскрыть информацию о владельце номера, который для другого пользователя неизвестный. Поэтому пользователь может только самостоятельно вычислить владельца неизвестного номера, с которого поступают звонки.

Операторы сегодня предлагают сервисы, позволяющие проверять номера телефонов на принадлежность к спаму. Такие услуги у провайдеров связи платные, а альтернативной является использование приложений для смартфонов, позволяющих определять спам. Однако такие услуги и сервисы не позволяют определить номера частных лиц.

Попытаться выяснить это можно через интернет. Однако, стоит иметь ввиду, что найти в сети информацию о номерах можно только если их владельцы являются мошенниками, или номер закреплен за компанией, а также если человек привязал номер к соцсети в открытом профиле.

Найти кому принадлежит неизвестный номер можно указав его в строке любого поисковика. После этого будет предложен список сайтов, на которых этот телефонный номер значится. В большинстве случаев это позволит со стопроцентной точностью выяснить регион привязки номера, и к какому оператору относится. Для этого даже не потребуется переходить по сайтам.

Если номер относится к какой-либо компании, то эта информация также отобразится на первой странице поиска. Также будут указаны ее другие контактные данные, в том числе и адрес.

О мошенниках информацию можно найти на сайтах, которые имеют отзывы пользователей. Их оставляют те, кто получал звонки с этих номеров. Если же и вы имеете информацию о мошенниках, которые доставили неудобства, то тоже можете оставить комментарий на таких сайтах, и помочь другим людям избежать неприятностей при общении с этим номером.

Как скрыть свой номер

Услуги позволяющие скрывать свой телефонный номер предоставляются всеми операторами, и как мы уже рассказали выше, стоимость такой услуги меньше, чем “супер определителя”. Большинство пользователей задают вопрос: будет ли определяться номер в сообщении если он скрыт?

Номер, который скрывается при помощи антиопределителя не отображается только во время голосовых звонков. В сообщениях скрыть номер при использовании услуг от операторов не получится. Поэтому если необходимо скрыть номер телефона при отправке СМС, то стоит просто использовать онлайн сервис, или другую симкарту, номер которой не известен получателю сообщения.

Для совершения звонков со скрытого номера МТС и МегаФон предлагают два ее варианта. Можно подключить услугу, и использовать скрытие номера при любом звонке, а при необходимости совершать звонки с открытым номером, используя специальную команду. Второй вариант, напротив, предлагает использовать скрытие номера только при определенных звонках. Билайн и Теле2 предлагают только первый вариант использования сервиса, но позволяют для отдельных звонков разрешить отображение номера.

Антиопределитель номера «CLIR»

Услуга «CLIR» (Запрет на определение номера) позволяет вам запретить другим абонентам сети МТС-Беларусь увидеть ваш мобильный номер при вызове.

Примечание: Мобильный номер СООО «Мобильные ТелеСистемы» может быть определен АОНом обычной городской сети.

Внимание!

Номер вашего телефона отображается:

• В детализированном счете вызываемого абонента;
• При отправке SMS;
• При записи сообщения на ГП, в информационном сообщении;
• При использовании услуги «Автодозвон»;
• Экстренные вызовы;
• Установленной функции телефона «свой номер определять» — вкл.;

Добавление/удаление услуги

• USSD — *111*236#;
• через Мобильный помощник 0870 253;
• через Интернет-помощник;
• WAP –помощник;
• звонок в Контактный центр;
• личный визит в Центр обслуживания абонентов МТС либо к официальным коммерческим представителям, уполномоченным на оказание дополнительных услуг.

Особенности работы услуги

1. Гарантировано номер абонента не будет определяться на телефонах абонентов МТС и в зоне действия сети МТС.

2. Номер будет определяться:

• в детализации разговоров
• при отправке SMS-, MMS-сообщений
• при получении SMS-уведомления с голосового ящика о поступлении нового сообщения
• при пользовании услугой автодозвон
• при звонке на экстренные службы
• при звонке на городской телефон с определителем номера
• при добавленной услуге и установленной функции телефона «Свой номер определяется/вкл.» — номер отправителя не скрывается если набрать команду *31#номер телефона в международном формате (для единичного звонка)
• для того, чтобы скрыть номер необходимо через меню телефона включить функцию, позволяющую скрыть номер либо воспользоваться командой #31# номер телефона в международном формате (для единичного звонка)

Стоимость услуги «Антиопределитель номера» зависит от тарифного плана абонента.

Как определить скрытый номер МТС

Для многих уже не секрет, что для того, что бы во время звонка не отображался номер нужно воспользоваться услугой МТС по скрытию мобильного номера – «Антиопределитель номера».

А вот, как сделать на оборот, чтобы скрытый номер звонящего абонента отображался? Тут есть два пути решения этого вопроса. Первый, вынудить написать звонящего сообщение (в этом случае услуга скрытия мобильного номера не работает).

Второй, это подключить ту самую новую услугу компании, которая позволяет определять скрытые мобильные номера – «Суперопределитель номера МТС». Услуга доступна всем желающим абонентам, как новым, так и старым, не зависимо от формы обслуживания.

Действует сервис исправно только на территории Украины, при использовании в роуминге могут быть сбои.

загрузка…

Как активировать Суперопределитель номера на МТС

Активация происходит разными методами для абонентов предоплаты и контрактников. Для предоплаченного обслуживания необходимо отправить пустое текстовое сообщение на номер

3410.

Для тех, кто не имеет возможности отправлять СМС, можно набрать комбинацию *101*410#.

Для пользователей, которые обслуживаются на договорной основе для активации нужно позвонить по номеру 111 и воспользоваться услугами оператора. Или же посетить ближайший фирменный магазин МТС, где оставить заявку на активацию.

Самостоятельно можно воспользоваться онлайн сервисом «Интернет помощник».

Сколько стоит пользование «Суперопределителем номера» МТС

Как известно многим пользователям контрактным абонентам есть уступки со стороны компании, так и в стоимости этого сервиса. Активация стоит 100 грн и оплачивается единоразово.

Кроме этой суммы абоненту придется платить ежемесячную абонплату в размере 30 гривен в месяц. В случае использования абонентов, которые подключены на предоплату, стоимость активации не изменяется и составляет 100 гривен единоразово.

Ежедневная стоимость использования составляет 1 гривна в день, что составляет на одну гривну больше от контрактной формы обслуживания.

загрузка…

Как отключить Суперопределитель номера МТС

Пользователи, что обслуживаются на предоплате, могут деактивировать данную услугу отправив пустое текстовое сообщение на номер 3411.

А те у которого нет возможности отправлять сообщения могут набрать комбинацию на мобильном телефоне *101*411# и нажать кнопку вызова.

Контрактные абоненты могут деактивировать сервис, обратившись в фирменный магазин МТС и оставив заявку на деактивацию. Еще один способ это звонок в call-центр МТС по номеру 111.

Также эту процедуру можно сделать при помощи онлайн сервиса «Интернет помощника». Повторная активация услуги будет оплачиваться согласно установленного тарифа и будет составлять 100 гривен.

Как узнать свой тариф на МТС с телефона по номеру

В целях изменения условий и оптимизации расходов на мобильную связь, абоненты должны знать текущую информацию по тарифному плану на номере. Подробная инструкция о том, как узнать свой тариф на МТС с телефона по номеру.

Актуальность данных действительна на момент выполнения пошаговых действий и до смены тарифа с одного на другой.

Определение

Тарифный план – это набор функций и дополнительных пакетов (минуты, SMS, гигабайты интернета), предоставляемые по ежемесячной абонентской плате или по факту использования.

Все тарифы МТС разработаны под определенные цели: выгодные звонки, комфортное общение за границей или в международном роуминге, доступный интернет на высокой скорости без ограничений.

Название тарифных планов постоянно меняется, как и условия со сроками действия решений. Планы, которые устаревают, автоматически переносят в архивные, без возможности активации.

Основные тарифные планы

В настоящее время действующими является несколько специализированных решений, каждое из которых открывает индивидуальные возможности и зависит от целевого использования.

Абоненты вправе самостоятельно определить для себя оптимальный по стоимости и количеству предоставляемых услуг тариф, в рамках условий.

Для перехода и подключения доступны:

• Супер МТС.
• Тарифище.
• Линейка тарифов Smart (Мини, Наш, Топ).
• Тариф Х (ИКС).
• Ультра Премиум.
• Отдельно для планшета, ноутбука или умных часов.
• Твоя страна.
• Red Energy.

Обратите внимание, что существуют тарифы без абонентской платы, в них деньги снимаются по фактическому потреблению ресурсов мобильной связи (звонки, SMS, интернет).

Как узнать свой тариф на МТС

При наличии действующей SIM карту пользователь может узнать свой тариф на МТС самостоятельно, без посещения салонов связи.

Ниже доступны 5 простых и рабочих инструкции, после пошагового выполнения которых вы будете знать название подключенного тарифного плана, его срок действия и кодовый номер.

USSD команда

Быстрый запрос по коду формата USSD позволит моментально узнать версию тарифа с кнопочных устройств или смартфонов даже без интернета.

Инструкция:

• Наберите комбинацию *111*59# и нажмите на кнопку «Вызов».
• Запрос будет инициирован и принят в обработку.
• В течение 1 минуты поступит SMS с названием тарифа и рекомендацией ознакомиться с ним подробнее в скачиваемом мобильном приложении Мой МТС.

Полезная информация: системные настройки предполагают использование англоязычных символов и для активации режима работы в транслитерации доступна специализированная комбинация *111*6*2#.

Через службу поддержки

Горячая линия МТС работает круглосуточно, специалисты службы технической поддержки обладают высоким уровнем знаний и квалификацией, что гарантирует получение исчерпывающего ответа по любому вопросу.

Как правильно позвонить оператору:

• Наберите с мобильного телефона номер 0890, если вы являетесь частным клиентом или 0990 при обращении от предприятия в качестве юридического лица.
• Используя цифровой блок на клавиатуре, нажмите цифру «5» (отвечает за категорию тарифов) и следом «0» (соединение с оператором).
• В течение 1-30 минут специалист подключиться к диалогу, и вы сможете задать ему все интересующие вопросы относительно текущего тарифного плана.

В некоторых случаях требуется идентификация клиента по паспортным данным, которые были указаны в регистрационной анкете при покупке SIM-карты.

Полезная информация: из-за большого количества обращений, контакт-центр компании МТС не справляется с нагрузками, ожидание ответа может составлять более 30 минут в будни с 8:00 до 23:00 и выходные дни с 18:00 до 01:00.

В мобильном приложении «Мой МТС»

Программный комплекс, который корректно устанавливается на мобильные устройства под управлением операционных систем Windows, Андроид или Apple IOS.

Является мобильной версией кабинета с урезанным функционалом. Открывает ряд дополнительных возможностей по самостоятельному изменению тарифного плана, подключению или отключению платных подписок, а также написанию обращений в службу поддержку через встроенную форму обратной связи.

Инструкция к приложению:

• Скачайте программу из официального источника (каталоги расширений). Запустите установку и откройте «Мой МТС».
• Нажмите на кнопку «Тарифы», она расположена на главной странице в центральной части экрана.
• В новом окне будет показано название тарифного плана, который активен на номере абонента в момент запроса.
• Вкладка «Доступные» покажет альтернативные варианты тарифов для домашнего региона. Подключение происходит автоматически с подтверждением по

Важно знать: рекомендуется обновлять приложения в целях безопасности и надежного хранения персональных данных (логин и пароль).

Онлайн кабинет абонента

Личный кабинет МТС – это бесплатный сервис для клиентов, доступный по адресу login.mts.ru с персональных компьютеров и мобильных устройств.

В кабинете создана удобная навигационная структура для быстрого перехода от одного раздела к другому.

Как узнать свой тариф на МТС через личный кабинет:

• Откройте официальный сайт МТС или целевой онлайн проект со страницей входа Login. mts.ru.
• Введите номер телефона и пароль от учетной записи. При утере доступа, код можно восстановить через SMS.
• На стартовой странице будет отображена подробная информация о сумме на балансе, абоненте и действующем тарифном плане.

Упаковка стартового пакета

Способ актуальный для тех, кто хранит все документы в надежном месте, а стартовый пакет с картой регистрации и пластиковой картой являются важным подтверждением права на номер.

Упаковка SIM карты представлена в виде фирменного конверта из твердого картона квадратного формата. На нем указан номер МТС и название тарифного плана (сзади над линией надрыва).

Контактная информация

Важным преимуществом является наличие постоянной поддержки со стороны оператора, которая доступна в некоторых формах (телефонные обращения, сообщения через социальные сети или посещение салона магазина).

Официальный сайт МТС: mts.ru

Горячая линия (служба поддержки): 0890 (частные лица) и 0990 (организации).

Отзывы

Уважаемые посетители, проект Mobile-LK готовит авторские материалы на востребованные посетителями темы и тщательно прорабатывает информацию перед публикацией на сайт. Пожалуйста, оцените качество статьи по шкале от 1 до 5.

На этой странице можно оставить комментарии по теме или задать вопрос, на который будет дан ответ от администрации с детальным изучением сути и индивидуальным подходом.

Надеемся, теперь вы понимаете как узнать свой тариф на МТС и один из способов предоставленных выше помог решить поставленную задачу.

Загрузка…

Три способа узнать лицевой счет МТС для оплаты Домашнего Интернета и ТВ

Автор Наталья Тимофеева На чтение 3 мин. Опубликовано 14.08.2020 Обновлено 14.08.2020

Каждому абоненту МТС, пользующемуся Интернетом, а также домашним ТВ от оператора, нужно знать свой лицевой счет. С его помощью легко определить задолженность за услуги связи и оплатить удобным способом.

Что такое номер лицевого счета

При подключении услуг связи абоненту компании присваивается персональный идентификатор, совпадающий с номером договора. Он служит для определения клиента при обращении на Горячую Линию и для проверки суммы платежа и оплаты.

Номер требуется и для решения других задач: для сдачи оборудования после аренды или ремонт, переоформления документов на другого пользователя и в иных случаях, когда человек обращается в Службу Поддержки или в офис провайдера.

Как посмотреть номер договора

Данные для идентификации указаны в бумагах, выданных при подключении к оператору и в Личном Кабинете. Их же можно узнать, позвонив в Контактный Центр.

В документах

Узнать номер своего лицевого счета пользователь МТС может в договоре. В нем также указаны контактный телефон человека, логин и пароль для доступа в Личный Кабинет.

В Личном Кабинете

Посмотреть данные договора возможно, если у клиента есть доступ к своему профилю. Авторизовавшись на сайте, пользователь сможет найти данные.

По телефону

Позвонив по телефону в кол-центр, пользователь сможет узнать номер лицевого счета МТС на Интернет. Нужно продиктовать свои паспортные данные или кодовое слово и сообщить ФИО клиента, на которого оформлен контракт, серийные цифры CAM-модуля или ресивера и смарт-карты (если подключено телевидение).

Наталья

Технический специалист, поддержка пользователей по вопросам мобильной связи.

Задать вопрос

Недостаток решения в том, что дозвониться до оператора часто удается сразу. Иногда освободившийся сотрудник отвечает через несколько минут.

Как проверить задолженность

Проверить остаток на лицевом счете МТС можно, позвонив в техподдержку или обратившись в офис продаж. Самостоятельно узнать по лицевому счету состояние баланса МТС ТВ и Интернета можно через Личный Кабинет.

Через контактный центр

Чтобы узнать задолженность за Интернет и ТВ, нужно позвонить в техническую поддержку. Дождавшись ответа оператора, нужно сообщить ему сведения о договоре и ФИО клиента, а также паспортные данные. Убедившись, что разговаривает с владельцем контракта, сотрудник продиктует сумму.

В Личном Кабинете

На сайте оператора в профиле пользователя можно проверить задолженность после авторизации на сайте. В разделе «Оплата» доступно пополнение баланса.

В салоне связи

В офисах провайдера абоненты могут по лицевому счету проверить баланс ТВ и Интернета МТС. Нужно продиктовать сотруднику свои данные и показать паспорт, чтобы подтвердить свою личность и выяснить сумму долга.

Как оплатить задолженность

Оплатить связь, определив сумму, можно:

• через Личный Кабинет;
• в приложении или на сайте сервиса «МТС Деньги»;
• в точках продаж на кассах или в терминале оплаты;
• в терминалах QIWI;
• через Сбербанк Онлайн или аналогичный сервис других банков и т.д.

Подробнее о способах пополнения баланса можно прочитать в отдельной статье, в разделе «Оплата кабельного ТВ».

Клиентам, пользующимся Интернетом и ТВ от провайдера, нужно знать номер своего договора. С его помощью можно определить сумму долга и оплатить ее, обратиться в Службу Поддержки, сдать в ремонт оборудование и решить другие задачи. Посмотреть сумму платежа за услуги компании можно в Личном Кабинете, через Горячую Линию или в салонах связи. Оплата вносится рядом удобных способов, абоненту предлагается выбрать оптимальный для себя и пользоваться им для внесения средств.

Наталья

Технический специалист, поддержка пользователей по вопросам мобильной связи.

Написать автору

Постараюсь помочь каждому пользователю в решении его проблемы, наиболее распространенные вы найдете на сайте. Обо мне почитать можно тут Наталья Тимофеева.

Как узнать свой номер МТС

Для каждого абонента компания МТС предоставляет услугу по определению своего номера, если он забыт. Чаще всего забывают именно новые номера, или те пользователи, которые только приобрели сим-карту и не успели его запомнить. Как узнать свой номер МТС расскажет эта статья.

Для каждого нового пользователя компании, или для каждой новой приобретенной клиентом сим-карты предусмотрены напоминания, в которые входит и номер телефона. Они высылаются при активации сим-карты прямо на телефон. Во избежание ситуаций, когда новый номер можно легко перепутать с другим, или попросту забыть, компания рекомендует не удалять сообщения-подсказки, а сохранить эту справочную информацию в телефоне, чтобы не приходилось потом узнавать номер другими способами. Такие оповещения бесплатны.Если же они были случайно удалены, их, по желанию, можно восстановить в сервисной службе компании.

Как узнать свой номер МТС?

Например, можно набрать номер другого абонента, который находится рядом с вами. И тогда ваш номер высветится на его телефоне. Можно позвонить в справочную службу компании. Для этого необходимо набрать короткий номер «0890» и следовать указаниям робота-автоответчика, либо дождаться ответа оператора который поможет решить вашу проблему. Для этого необходимо будет указать данные, на кого зарегистрирован договор с компанией.

В основном используют три основных способа, для того, чтобы узнать свой забытый номер. Это можно осуществить посредством бесплатного звонка в единый центр ООО «МТС», набрав номер «0887». При снятии трубки вам сообщат номер забытого мобильного.

 

В последнее время очень популярен «Мобильный портал». Для того, чтобы воспользоваться его услугами, и ответить на вопрос о том, как узнать свой номер МТС, следует набрать «*111#». Необходимо ответить ответа автоинформатора, после чего появится меню, в котором нужно нажать кнопку «Мои данные» или поставить напротив нее галочку. В открывшемся меню будет виден ваш номер.

Узнать забытый номер можно набрав *111*0887#, и вызов. Сервис бесплатно как внутри своей сети, так и при нахождении за границей и в роуминге.

Руководство по жизнеспособности клеток

| Как измерить жизнеспособность клеток

Как выбрать анализ здоровья клеток

Выбор теста на здоровье клеток может оказаться сложной задачей. Здесь мы приводим ряд факторов, которые следует учитывать при выборе клеточных анализов для ручных или автоматизированных систем.

Что вы хотите измерить?

Какие клетки, жизнеспособные или мертвые, вы хотите обнаружить в конце эксперимента? Существуют анализы здоровья клеток, которые специально определяют количество живых клеток (анализы жизнеспособности), количество мертвых клеток (анализы цитотоксичности) и для оценки механизма гибели клеток (анализы апоптоза).Если запрошенная информация предназначена просто для подтверждения того, существует ли разница между отрицательными контролями «без обработки» и «обработкой токсином» экспериментальных лунок, выбор между измерением количества жизнеспособных клеток или количества мертвых клеток может быть неуместным. Однако, если требуется более подробная информация о механизме гибели клеток, критическими становятся продолжительность воздействия токсина, концентрация тестируемого соединения и выбор конечной точки анализа (1). Изучите следующие соображения, которые помогут вам определить, что вы хотите измерить и какие анализы могут вам помочь.

Какая у вас модельная система?

Виды происхождения и типы клеток, используемые в исследованиях здоровья клеток, часто диктуются конкретными целями проекта или исследуемой мишенью для лекарственного средства. Независимо от выбранной модельной системы, важно установить последовательную и воспроизводимую процедуру культивирования клеток и установку аналитических планшетов. Изменение количества клеток на лунку или периода уравновешивания перед проведением анализа может повлиять на физиологию клеток. Поддержание и обращение с исходными культурами клеток на каждом этапе процесса должны быть стандартизованы и проверены на согласованность.Кроме того, обязательно используйте известные положительные и отрицательные контроли на протяжении всего эксперимента, чтобы получить общее представление о физиологическом состоянии клеток. Поскольку природа образца может варьироваться в зависимости от типа клеток и от того, является ли он двухмерной или трехмерной моделью культуры, процедура анализа должна быть подтверждена для каждой системы модели культуры. Модельная система, которая требует использования меньшего числа клеток, например, с первичными клетками или другими ограниченными типами клеток, потребует анализа с повышенной чувствительностью.

Вы используете 2D или 3D культуры клеток?

Клетки в культуре являются только модельной системой и отличаются от клеток в их нормальной среде in vivo. Многие исследователи сейчас используют трехмерные культуры клеток для более точного имитации условий in vivo. Вместо того, чтобы расти в монослое на поверхности планшета, клетки в трехмерной культуре растут в конформации, которая позволяет им взаимодействовать друг с другом, образуя связи между клетками. Эта дополнительная сложность может создать проблемы для экспериментального дизайна при проведении анализов на основе клеток, поскольку реагенты для анализа могут иметь трудности с достижением центра больших микротканей, а литические анализы могут не разрушить все клетки в трехмерной системе.Может потребоваться оптимизация анализов для 3D-систем путем изменения состава реагентов с более сильными детергентами и включения механического разрушения и увеличения времени инкубации. Колориметрические анализы, такие как МТТ, не оптимальны для использования с трехмерными культурами клеток, поскольку они имеют ограниченную способность проникать в несколько слоев клеток.

3D-анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ^® (№ по каталогу G9681) специально разработан для определения жизнеспособности клеток в 3D-моделях культур. Реагент для анализа обладает повышенной литической способностью, что позволяет лучше проникать в большие образцы сфероидов, что приводит к более точному определению жизнеспособности по сравнению с другими методами анализа.Реагент для анализа CellTiter-Glo ^® 3D измеряет АТФ как индикатор жизнеспособности и генерирует люминесцентные данные, которые намного более чувствительны, чем колориметрические или основанные на флуоресценции методы.

Для измерения цитотоксичности соединения тест на цитотоксичность LDH-Glo ™ (№ по каталогу J2380) идеально подходит для использования с 3D-моделями культур. Вместо того, чтобы полагаться на проникновение через клеточную мембрану, анализ измеряет высвобождение ЛДГ из мертвых клеток в среду. Для анализа требуется удалить только небольшие объемы среды (2–5 мкл), что позволяет проводить повторный отбор образцов с течением времени.Это сохраняет микроткани и поддерживает оставшиеся жизнеспособные клетки, что позволяет использовать образцы для дополнительных последующих применений, с другими анализами или для анализа нуклеиновых кислот, чтобы получить больше данных с использованием тех же образцов.

Когда подходящее время для проведения анализа здоровья клеток?

Сопоставление обнаруженного маркера анализа с необходимой информацией жизненно важно для выбора подходящего анализа состояния клеток. Базовое понимание изменений, происходящих во время различных механизмов гибели клеток, поможет вам решить, какой анализ выбрать.На рисунке 9 показан упрощенный пример, иллюстрирующий хронологические изменения, происходящие во время апоптоза и некроза, и результаты, которых можно было бы ожидать при использовании анализов, измеряющих различные маркеры.

Рисунок 9. Механизмы гибели клеток можно определить путем измерения различных маркеров жизнеспособности клеток, цитотоксичности и апоптоза in vitro.

Клетки, подвергающиеся некрозу, обычно быстро набухают, теряют целостность мембран, останавливают метаболизм и высвобождают свое цитоплазматическое содержимое в окружающую культуральную среду.Клетки, подвергающиеся быстрому некрозу in vitro, не имеют достаточно времени или энергии для активации апоптотического аппарата и не будут экспрессировать апоптотические маркеры.

Измерение апоптоза и некроза

Щелкните ниже, чтобы ознакомиться с нашим широким спектром тестов и реагентов для определения апоптоза.

Изучите тесты на апоптоз

Культивируемые клетки, подвергающиеся апоптозу in vitro, в конечном итоге подвергаются вторичному некрозу. После продолжительной инкубации апоптотические клетки в конечном итоге отключают метаболизм, активируют каспазы, переводят фосфатидилсерин (ФС) на внешнюю мембрану, теряют целостность мембраны и высвобождают свое цитоплазматическое содержимое в культуральную среду. Маркеры апоптоза, такие как активность каспазы или экспозиция PS на поверхности клетки, могут присутствовать только временно. Следовательно, для определения основного механизма гибели клеток критически важно понимание кинетики процесса гибели клеток в вашей модельной системе. Чтобы не пропустить критический момент времени, вы можете выбрать нелитический анализ в реальном времени, такой как анализ апоптоза и некроза аннексина V RealTime-Glo ™ (каталожный номер JA1011), который позволяет многократно считывать показания одного анализа в течение более длительного периода. время.

Вам нужно собирать данные из нескольких временных точек?

Кинетические анализы живых клеток — это реагенты для обнаружения, которые позволяют многократно измерять одну и ту же лунку образца в нескольких временных точках.Это экономит ваше время и усилия, позволяя собирать более информативные данные в режиме реального времени. Если вам нужно провести эксперименты по времени и реакции на дозу, чтобы определить начало или механизм токсичности лекарственного средства, вам, вероятно, будет полезен анализ в реальном времени. Особенно если вы используете ограниченные или ценные образцы клеток, очень важно получить как можно больше данных из вашего образца. Promega предлагает набор тестов для определения кинетического здоровья живых клеток.

Анализ жизнеспособности клеток RealTime-Glo ™ MT (кат.# G9711) позволяет непрерывно контролировать жизнеспособность клеток в одной и той же лунке образца до 72 часов в зависимости от количества клеток. Анализ измеряет снижающий потенциал жизнеспособных клеток и не зависит от АТФ, обеспечивая ортогональный метод определения жизнеспособности. Анализ апоптоза и некроза аннексина V RealTime-Glo ™ (№ по каталогу JA1011) — это метод на основе планшет-ридера, который измеряет в реальном времени воздействие фосфатидилсерина (ФС) на внешний листок клеточных мембран во время процесса апоптоза.Комбинация и синхронизация люминесцентных (апоптотических) и флуоресцентных (некротических) сигналов используется для дифференциации вторичного некроза от некроза, вызванного другими цитотоксическими явлениями. В тесте CellTox ™ Green Cytotoxicity Assay (№ по каталогу G8741) используется краситель, который производит флуоресцентный сигнал при связывании с ДНК в клетках с нарушенной мембраной. Этот анализ можно применять непосредственно к клеткам при посеве или при обработке тестируемым соединением в любой момент времени инкубации, что позволяет в реальном времени кинетическое измерение начала цитотоксичности.

Поскольку эти анализы нетоксичны и нелитичны, оставшиеся жизнеспособные клетки остаются нетронутыми для дополнительных последующих применений, что приводит к большему количеству данных на образец.

Узнайте больше о нашем портфеле кинетических анализов живых клеток!

Читать далее

Сколько образцов нужно протестировать?

Если необходимо измерить только один или несколько образцов, может быть достаточно ручного подсчета живых или мертвых клеток с помощью гемацитометра. Методы визуализации или проточной цитометрии также полезны для небольшого количества образцов, но менее подходят для приложений с высокой пропускной способностью. Если будет измерено большое количество образцов, наиболее эффективными будут гомогенные анализы, не требующие промывки клеток или этапов центрифугирования. Кроме того, время, необходимое для приготовления реагента и инкубации, должно быть минимальным. Стабильность сигнала поглощения, флуоресценции или люминесценции — еще один важный фактор, обеспечивающий удобство и гибкость при записи данных и сводящий к минимуму вариабельность при обработке больших партий планшетов. Для скрининга тысяч образцов полезно выбирать анализы, которые достаточно чувствительны, чтобы позволить миниатюризацию в форматы планшетов с высокой плотностью (384- или 1536-луночные планшеты).

Promega производит широкий ассортимент тестов здоровья клеток на основе планшет-ридеров, которые являются быстрыми, высокочувствительными, простыми и совместимыми с высокопроизводительными измерениями (2). В то время как общий протокол для большинства этих «гомогенных» анализов — это добавление-смешивание, некоторые протоколы могут требовать этапов переноса, инкубации или перемешивания. Мы рекомендуем полностью изучить протоколы анализа, чтобы определить, соответствует ли рабочий процесс вашим потребностям.

Найдите правильный анализ для ваших нужд

Щелкните ниже, чтобы сравнить различные анализы на планшетах Promega, предназначенные для измерения жизнеспособности клеток, цитотоксичности и апоптоза.

Сравните наши анализы здоровья клеток

Какая требуется чувствительность?

Еще один фактор, который следует учитывать при выборе анализа, — это чувствительность обнаружения. Требуемая чувствительность тесно связана с количеством клеток, используемых на образец. В общем, люминесцентные анализы более чувствительны, чем анализы, основанные на обнаружении флуоресценции или поглощения, поскольку минимальная фоновая люминесценция приводит к высоким отношениям сигнал / шум. При обнаружении флуоресценции собственная флуоресценция клеток, сложная флуоресценция и спектральное перекрытие между длинами волн возбуждения и излучения могут привести к снижению отношения сигнал / шум.

Чувствительность обнаружения будет зависеть от типа клетки, если вы выберете измерение метаболического маркера, такого как уровень АТФ или снижение уровня тетразолия MTS. Отношение сигнал / фон в некоторых анализах можно улучшить, увеличив время инкубации. Чувствительность детектирующего реагента зависит от обоих параметров модельной системы, таких как формат планшета и количество клеток на лунку; в дополнение к оцениваемому параметру, например, снижению жизнеспособности клеток. Анализы, предназначенные для обнаружения изменения жизнеспособности в популяции из 10 000 клеток, могут не требовать самой чувствительной технологии анализа.Например, анализ тетразолия, такой как анализ нерадиоактивной пролиферации клеток CellTiter 96 ^® (№ по каталогу G4000), должен легко обнаружить разницу между 10 000 и 8 000 жизнеспособных клеток. С другой стороны, модельные системы анализа, которые используют низкое количество клеток в формате многолуночного планшета с высокой плотностью, могут потребовать максимальной чувствительности обнаружения, такой как та, которая достигается с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo ^® (№ по каталогу G7570). который может легко обнаружить менее 100 ячеек.

Насколько стабильны реагенты?

Для исследователей, использующих автоматизированные высокопроизводительные скрининговые платформы, стабильность реагентов и совместимость с роботизированными компонентами часто вызывают озабоченность. Реагенты для анализа должны быть стабильными при температуре окружающей среды в течение достаточного периода времени для полного распределения по нескольким планшетам. Кроме того, сигнал, генерируемый анализом, должен быть стабильным в течение продолжительных периодов времени, чтобы обеспечить гибкость для записи данных либо последовательно, либо в пакетном режиме обработки.Тест на жизнеспособность клеток CellTiter-Glo® 2.0 разработан для хранения при температуре окружающей среды в течение нескольких дней и генерирует стабильный люминесцентный сигнал с периодом полураспада, который позволяет обрабатывать партии.

Какие инструменты вам понадобятся?

В некоторых случаях выбор метода анализа может быть продиктован доступностью оборудования для определения оптической плотности, флуоресценции или люминесценции. Наш портфель анализов содержит дополнительный формат обнаружения для каждого из трех основных классов анализов здоровья клеток (жизнеспособность, цитотоксичность или апоптоз).Кроме того, результаты некоторых анализов, таких как анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo ^® (№ по каталогу G7570), могут быть записаны с помощью более чем одного типа инструментов (люминометра или камеры CCD).

Откройте для себя инструмент, который подойдет именно вам

Приборы для считывания микропланшетов

GloMax® — это простые в использовании модульные системы обнаружения, которые обеспечивают большую гибкость при разработке аналитических экспериментов на планшетах. Эти инструменты без проблем работают с анализами Promega благодаря предварительно загруженным протоколам для простого и быстрого обнаружения.

Просмотр инструментов

Какие пластины подходят для использования?

При использовании наших анализов на планшетах выбор правильного типа планшета зависит от ваших исследовательских потребностей. Если требуется микроскопическое исследование клеток, необходимы непрозрачные чашки с прозрачным дном.

Как правило, непрозрачные черные планшеты используются для уменьшения фона для флуоресцентных анализов, а непрозрачные белые планшеты используются для оптимального светового потока для люминесцентных анализов. Однако мощность сигнала от большинства люминесцентных тестов достаточна, чтобы можно было использовать черные пластины.Использование черных планшетов для люминесцентных анализов обеспечивает максимальную гибкость для мультиплексирования флуоресцентных и люминесцентных анализов из одного и того же образца. Прозрачные планшеты приемлемы для использования с колориметрическими анализами, но не должны использоваться с флуоресцентными или люминесцентными анализами. Выбор подходящего прибора и пластин может помочь вам уменьшить перекрестные помехи и другие проблемы, которые могут искажать ваши данные.

Вы хотите провести более одного анализа с вашим образцом (мультиплексным)?

Мультиплексирование более чем одного анализа — это универсальный подход, который может предоставить больше информации из одного образца. Например, вы можете одновременно измерять события пути реакции клеточного стресса и механизм гибели клеток в одной лунке с образцом или измерять жизнеспособность клеток с помощью репортерного ответа, чтобы привести результаты к количеству живых клеток. Мультиплексирование требует совместимости используемых методов анализа и способности различать отдельные сигналы с использованием различных длин волн обнаружения или обнаружения различных модальностей, таких как флуоресценция и люминесценция. Для совместимых химических методов анализа мультиплексирование может выполняться одновременно в одной лунке для образца.Для некоторых комбинаций анализов измерения необходимо проводить последовательно. Также можно включить другие варианты мультиплексирования, разделив часть образца в другой контейнер, чтобы преодолеть несовместимость химического анализа, требования к инструментам или формат планшетов (например, прозрачный против непрозрачного пластика). Например, анализ цитотоксичности LDH-Glo ™ (каталожный номер J2380) дает возможность собрать несколько точек данных путем удаления небольших аликвот культурального супернатанта на белый непрозрачный аналитический планшет, таким образом оставляя исходный аналитический планшет, содержащий клетки, доступным для других анализов. такие как анализ репортерного гена, анализ изображений, анализ нуклеиновых кислот и т. д.

Мультиплексирование анализов в лунке для образцов устраняет необходимость в нескольких параллельных образцах для разных анализов и может сэкономить ваше время, усилия и затраты, а также обеспечить статистическое преимущество по сравнению с использованием параллельных образцов. Некоторые из наших анализов гомогенной цитотоксичности, апоптоза и жизнеспособности могут быть объединены без переноса среды, что позволяет исследователям анализировать несколько параметров в одной лунке с образцом.

Примеры протоколов мультиплексирования:

Воспроизводится ли анализ?

Воспроизводимость данных — важный фактор при выборе коммерческого анализа.Тем не менее, для большинства клеточных анализов вариация среди повторяющихся образцов, скорее всего, будет вызвана клетками, а не химией анализа. Вариации во время посева клеток можно увеличить, используя клеточные линии, которые имеют тенденцию образовывать сгустки, а не суспензию отдельных клеток. Увеличенные периоды инкубации и краевые эффекты в чашках также могут привести к снижению воспроизводимости между повторами и менее желательным значениям Z’-фактора (2). При выборе анализа ключевым моментом является понимание причин вариабельности результатов.

Сколько стоит?

Обычно существует компромисс между стоимостью реагента и качеством анализа или удобством, которое он обеспечивает пользователю. Менее дорогие реагенты часто имеют более сложные процедуры, ограниченную чувствительность или вызывают токсичность для клеток в культуре из-за более длительной инкубации и более длительного выполнения. Несмотря на эти общие недостатки, может быть много приложений, где подходят менее дорогостоящие анализы; однако следует проявлять осторожность, чтобы избегать цитотоксических реагентов, поскольку они могут повлиять на результаты анализа или ограничить возможность мультиплексирования с другими анализами.

Имеющиеся в продаже реагенты и наборы для анализа с контролируемым качеством обычно более дороги, но часто экономят время и деньги в долгосрочной перспективе, избегая повторных экспериментов или невоспроизводимых результатов. Например, даже если стоимость реагента для анализа жизнеспособности клеток АТФ может быть выше, чем для других анализов, скорость (экономия времени), чувствительность (экономия образцов клеток) и точность (достоверность данных) могут перевесить первоначальные затраты. Анализы с хорошей чувствительностью обнаружения, которые легче масштабировать до 384- или 1536-луночных форматов, могут привести к экономии реагентов для культивирования клеток и сделать возможным тестирование очень небольших количеств дорогих или редких тестируемых соединений и типов образцов, особенно первичных клеток.Анализы, способные выполнять измерения в реальном времени, также могут снизить затраты и сэкономить время за счет устранения необходимости дублировать планшеты для экспериментов с изменением времени.

CellTiter 96® AQueous One Solution Анализ пролиферации клеток | Анализ MTS

CellTiter 96® AQ _ueous One Solution Cell Proliferation Assay — это колориметрический метод определения количества жизнеспособных клеток в анализах пролиферации, цитотоксичности или химиочувствительности. Реагент CellTiter 96® AQ _ueous One Solution содержит соединение тетразолия [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолий, внутренняя соль; MTS] и реагент электронной связи (феназинэтосульфат; PES).PES обладает повышенной химической стабильностью, что позволяет комбинировать его с MTS с образованием стабильного раствора.

Анализы

выполняются путем добавления небольшого количества реагента CellTiter 96® AQ _ueous One Solution Reagent непосредственно в лунки для культивирования, инкубации в течение 1–4 часов и затем регистрации оптической плотности при 490 нм с помощью считывающего устройства для 96-луночных планшетов. Количество формазанового продукта, измеренное по величине поглощения 490 нм, прямо пропорционально количеству живых клеток в культуре.

Если вы в настоящее время используете анализ включения [ ³ H] -тимидина, добавление реагента CellTiter 96® AQ _ueous One Solution Reagent может заменить импульс [ ³ H] -тимидина в момент времени в проба, когда обычно добавляют пульс радиоактивного тимидина. Предыдущие данные биоанализа, сравнивающие включение [ ³ H] -тимидина с анализом CellTiter 96® AQ _ueous на основе MTS и исходным анализом CellTiter 96® на основе MTT, демонстрируют, что реагенты тетразолия могут быть заменены на [ ³ H] включение -тимидина.

Особенности и преимущества

Простой формат «добавить-инкубировать-измерить» (одностадийное добавление реагента) позволяет разрабатывать гомогенные высокопроизводительные скрининговые анализы. В отличие от МТТ, анализ можно использовать как единый раствор, он стерилизован на фильтре и готов к добавлению в аналитические планшеты.Требуется меньше этапов, поскольку анализ можно проводить в 96-луночных планшетах без этапов промывки или сбора клеток. Кроме того, исключаются этапы солюбилизации, обычно требуемые для анализов МТТ.

Анализ обеспечивает гибкость, так как планшеты можно считывать и возвращать в инкубатор для дальнейшего развития цвета, а также с удалением летучих органических растворителей для солюбилизации продукта формазана и радиоактивных реагентов, обычно требуемых для аналогичных анализов, CellTiter 96® AQ _ueous Тест на пролиферацию клеток с одним решением более безопасен в использовании.

Простой анализ клеточного цикла с высоким содержанием клеток выявляет частые расхождения между количеством клеток и анализами пролиферации АТФ и MTS

Abstract

Чтобы эффективно охарактеризовать как антипролиферативную активность, так и механизм действия малых молекул, нацеленных на клеточный цикл, мы разработали высокопроизводительный анализ на основе изображений для определения количества клеток и фазового распределения клеточного цикла. Используя это, мы профилировали эффекты экспериментальных и одобренных противораковых агентов с различными механизмами действия на набор клеточных линий, сравнивая прямой подсчет клеток и в двух форматах анализа жизнеспособности / пролиферации клеток на основе метаболизма: АТФ-зависимая биолюминесценция, Восстановление MTS (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолий) и анализ флуоресценции ДНК-связывающего красителя на всю лунку.Мы показываем, что, в зависимости от механизмов действия соединения, прокси-анализы, основанные на метаболизме, часто склонны к 1) значительной недооценке эффективности и эффективности соединения и 2) немонотонным кривым доза-ответ из-за зависимого от концентрации фенотипического «переключения». . В частности, эффективность и эффективность агентов, нацеленных на синтез ДНК, таких как гемцитабин и этопозид, могут быть сильно недооценены с помощью анализов восстановления АТФ и MTS. В том же анализе, основанном на изображениях, мы показали, что вызванное лекарством увеличение содержания АТФ было связано с увеличением размера клеток и пропорциональным увеличением содержания митохондрий и дыхательного потока одновременно с остановкой клеточного цикла.Таким образом, различия в механизме действия соединений и ответах, специфичных для клеточных линий, могут приводить к значительно вводящим в заблуждение результатам при использовании анализов восстановления АТФ или тетразолия в качестве заместителя числа клеток при скрининге соединений на антипролиферативную активность или профилировании панелей клеточных линий на чувствительность к лекарствам.

Цитирование: Chan GKY, Kleinheinz TL, Peterson D, Moffat JG (2013) Простой анализ клеточного цикла с высоким содержанием клеток выявляет частые расхождения между количеством клеток и анализами пролиферации АТФ и MTS. PLoS ONE 8 (5): e63583. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583

Редактор: Рафаэль Морено-Санчес, Instituto Nacional de Cardiologia, Мексика

Поступила: 15 мая 2012 г .; Одобрена: 8 апреля 2013 г .; Опубликовано: 17 мая 2013 г.

Авторские права: © 2013 Chan et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить.

Конкурирующие интересы: GKYC, TLK и JGM владеют акциями «Рош». Все авторы являются сотрудниками Genentech, входящей в группу компаний Roche. Нет никаких патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Тесты пролиферации на планшетах являются фундаментальным инструментом в открытии онкологических лекарств для оценки активности соединений и чувствительности различных клеточных линий к конкретным агентам.Исторически прямые измерения количества клеток не были практичными с высокопроизводительными тестами на микротитровальных планшетах, особенно с 384- и 1536-луночными планшетами высокой плотности. Поэтому наиболее распространенный подход к оценке количества клеток, их пролиферации и жизнеспособности, в зависимости от точки зрения исследователя, заключается в измерении количества на лунку какого-либо аспекта клеточного метаболизма или биомассы в качестве заместителя количества жизнеспособных клеток. . Тщательный обзор этих и других косвенных анализов количества клеток был недавно представлен Quent et al [1].В этом исследовании мы сосредоточимся на трех наиболее распространенных методах; определение АТФ в клеточных лизатах с помощью люциферин / люциферазной биолюминесценции (например, CellTiter-Glo (Promega), ATPlite (Perkin Elmer)) [2] — [4], восстановления солей тетразолия, таких как MTS и MTT, до формазана клеточными дегидрогеназами , (митохондриальный и др. ) [3], [5] — [7], и определение общего количества нуклеиновой кислоты на лунку флуоресцентных дцДНК-связывающих цианиновых красителей (например, CyQuant (Invitrogen), picoGreen (Invitrogen)) [8] .Обычно эти анализы не определяют абсолютные массовые количества или молярные концентрации аналитов, но дают сигналы, которые, как было продемонстрировано, имеют широкий динамический диапазон и линейный отклик в пределах соответствующих концентраций аналита.

При использовании этих анализов как эффективность (обычно EC ₅₀ или IC ₅₀ ), так и эффективность (процент снижения ответа по сравнению с необработанными контролями, E _max ) являются критическими параметрами для интерпретации кривых доза-ответ соединения, например различия на E _max может быть достаточно, чтобы различить цитостатический и цитотоксический механизмы действия (МоА).

Центральным элементом интерпретации этих данных с точки зрения воздействия лечения на «пролиферацию», «количество клеток» или «жизнеспособность» является предположение о том, что существует линейная зависимость между количеством клеток и сигналом, то есть количество аналита или активности на клетку остается неизменным. Однако это предположение не всегда оправдано. Например, соединение, которое увеличивает размер клеток без изменения цитоплазматической концентрации АТФ, может оказаться менее эффективным в анализе АТФ, чем его фактическое влияние на количество клеток.Эта возможность подтверждается имеющимися в литературе данными о сложной регуляции клеточного энергетического метаболизма и функции митохондрий во время апоптоза и в ответ на лечение различными противораковыми препаратами [9] — [14].

В отличие от этих прокси-анализов, микроскопия и анализы с высоким содержанием с использованием ДНК-связывающих красителей для визуализации ядер клеток позволяют напрямую определять количество клеток, избегая этих потенциальных мешающих факторов. Кроме того, визуализация и количественное определение ядерной интенсивности и морфологии является богатым источником информации о соединении МоА, особенно для лечения, которое влияет на клеточный цикл и выживаемость клеток.Понимание механизмов действия имеет решающее значение для оптимизации лекарств-кандидатов, поскольку нецелевые активности, включая, но не ограничиваясь, цитотоксичность, часто являются смешивающим фактором в анализах. Кроме того, при профилировании чувствительности панели клеточных линий к конкретному представляющему интерес агенту фенотипические ответы различных клеточных линий как на целевую, так и на внешнюю активность могут быть как информативными, так и искажающими.

Мы сообщаем здесь о разработке и внедрении простого анализа на основе изображений без отмывки для одновременного определения абсолютного количества клеток и распределения фаз клеточного цикла адгезивных или суспензионных клеток в 384-луночных планшетах.Используя этот анализ, мы можем легко дифференцировать МоА разных агентов на одной и той же клеточной линии, один и тот же агент на разных клеточных линиях и, что критически, продемонстрировать, что нередко одно лекарство имеет разные МоА в разных концентрациях.

Используя данные прямого подсчета клеток, мы демонстрируем, что MoA препарата и вариации клеточной линии могут вносить вклад в значительную недооценку активности и / или максимальной эффективности при использовании анализов снижения АТФ или MTS по сравнению с фактическим количеством клеток, присутствующих в лунке. Хотя аналогичные наблюдения были сделаны ранее с конкретными соединениями, сравнивающими различные форматы непрямых анализов, мы систематически исследовали группу нацеленных на клеточный цикл и химиотерапевтических агентов, представляющих несколько механизмов действия. Мы также искали механистическое объяснение этих наблюдений. Этот анализ показывает, что различия в форматах анализов связаны с изменениями объема цитоплазмы и митохондриальной массы, вызванными лекарствами с различными MoA, нацеленными на клеточный цикл.Следовательно, понимание MoA препарата или, по крайней мере, осведомленность о потенциальном воздействии различных MoA на считывание результатов анализа, имеет решающее значение для выбора подходящей стратегии анализа и обеспечения точного анализа и интерпретации данных.

Материалы и методы

Культура клеток

Клеточные линии получали из ATCC (Манассас, Вирджиния) и поддерживали в полной питательной среде: RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma; Сент-Луис, Миссури) и 1X GlutaMAX ™ (Life Technologies; Карлсбад, Калифорния).

Комплексное лечение

Ингибиторы были получены собственными силами и у коммерческих поставщиков: афидиколин, цисплатин, доксорубицин, этопозид, нокодазол и винбластин (EMD Chemicals; Филадельфия, Пенсильвания), гемцитабин (Tocris, Ellisvile, MO), паклитаксел-5 (Life Technologies), (Сигма). Все остальные соединения были синтезированы в Genentech. Клетки высевали в 384-луночные планшеты при соответствующей плотности для каждой клеточной линии в 45 мкл среды и оставляли при комнатной температуре (RT) на 30 минут перед инкубированием при 37 ° ° C в течение ночи для прикрепления.Предварительная инкубация при комнатной температуре сводит к минимуму температурные градиенты, в то время как клетки оседают на дно аналитических планшетов, что обеспечивает более равномерное распределение клеток в лунке [15]. Соединения серийно разводили в ДМСО и затем разбавляли до конечной концентрации в 16 раз в среде перед добавлением 3 мкл соединения к клеткам. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,25%. Клетки инкубировали с соединениями при 37 ° C в течение 1-3 дней без дальнейшей смены среды или повторного добавления соединений.

Анализы «пролиферации»

Анализ CellTiter-Glo (Promega): Измерения проводили в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, планшеты вынимали из инкубатора и давали уравновеситься при комнатной температуре в течение 20 минут, и равный объем реагента CellTiter-Glo добавляли непосредственно в лунки. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере и люминесценцию измеряли на считывающем устройстве Envision (PerkinElmer). Показания люминесценции были нормализованы и выражены как относительный процент от усредненного для планшета контроля ДМСО.

CellTiter-AQueous MTS assay (Promega): Измерения проводили в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, 10 мкл реагента MTS добавляли непосредственно в лунки, и планшеты с клетками инкубировали при 37 ° ° C в течение минимум 1 часа. Поглощение измеряли при 490 нм на ридере SpectraMax Plus384 (Molecular Devices; Саннивейл, Калифорния). Фоновое поглощение сначала вычитали с использованием набора лунок, содержащих только среду, затем нормализовали и выражали как относительный процент усредненного на планшете контроля ДМСО.

Прямой анализ CyQUANT: Измерения проводили в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies).Реагент для 2Х детектирования получали добавлением поставляемого прямого красителя нуклеиновой кислоты и прямого подавителя фона I в среду для культивирования клеток. Затем равный объем этого реагента для двукратного обнаружения добавляли непосредственно в лунки, и планшеты с клетками инкубировали при 37 ° ° C в течение 1 часа. Флуоресценцию измеряли при возбуждении 508 нм и эмиссии 527 нм на ридере Infinite® M1000 PRO (Tecan; Männedorf, Швейцария). Фоновую флуоресценцию сначала вычитали с использованием набора лунок, содержащих только среду, затем нормализовали и выражали как относительный процент усредненного в планшете контроля ДМСО.

Анализ клеточного цикла FACS

Клетки

HT29 высевали в чашки диаметром 10 см и оставляли для прикрепления в течение ночи при 37 ° C. Среду отсасывали и заменяли средой, содержащей подходящую концентрацию соединения. Клетки дополнительно инкубировали с соединениями в течение 24 часов при 37 ° ° C перед сбором, дважды промывали и ресуспендировали в 2 мл PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Клетки фиксировали холодным 70% этанолом в течение не менее 1 часа при 4 ° ° C.После 2 промываний PBS клетки ресуспендировали в 2 мл раствора для окрашивания йодида пропидия (PI) / РНКазы (Cell Signaling Technology; Danvers, MA) и инкубировали не менее 3 часов при 4 ° C. Клетки анализировали с помощью BD. Проточный цитометр FACSCalibur ™ (BD Bioscience; Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Сигнал флуоресценции PI на пике FL2-A в зависимости от количества использовали для определения распределения клеточного цикла.

Анализ клеточного цикла с высоким содержанием

После обработки соединением клетки фиксировали, повышали проницаемость и окрашивали ядра в одну стадию путем добавления равного объема забуференного фосфатом физиологического раствора, содержащего двукратную конечную концентрацию 0.25% параформальдегида (Electron Microscopy Sciences; Hatfield, PA), 0,075% сапонина (Sigma) и 2 мкг / мл Hoechst 33342 (Life Technologies) непосредственно в лунки. Планшеты с клетками инкубировали в темноте при комнатной температуре на шейкере в течение 30 минут перед визуализацией в системе скрининга высокого содержания Opera ® (PerkinElmer Inc). Изображения были получены с использованием 10-кратного иммерсионного объектива и неконфокального УФ-канала. Для каждой лунки было записано шесть полей изображения, что соответствует примерно 40% площади лунки.

Обнаружение митохондрий

Живые клетки инкубировали с 100 нМ MitoTracker Deep Red FM (Life Technologies) с или без 200 нМ TMRE (этиловый эфир тетраметилродамина, Life Technologies) при 37 ° ° C в течение 30 минут. Затем клетки могут быть визуализированы вживую на этом этапе или, в нашем случае, зафиксированы и окрашены, как описано выше, чтобы обеспечить одновременный анализ клеточного цикла. Конфокальные изображения получали с использованием прибора Opera одновременно с изображениями флуоресценции ДНК, как описано выше, с использованием лазера возбуждения 635 нм и дихроичного излучения 690/50 для MitoTracker Deep Red и возбуждения 532 и излучения 585/50 для TMRE.

Измерение уровня потребления кислорода

Клетки высевали из расчета 20 000 клеток на лунку в 96-луночные микропланшеты для культивирования клеток XF (Seahorse Bioscience), предварительно обработанные поли-D лизином, и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2. Для анализа скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного подкисления питательную среду заменяли предварительно нагретой средой без бикарбоната и сыворотки, и планшет загружали в анализатор внеклеточного потока XF96 (Seahorse Bioscience). Измерения исходного уровня OCR были определены для клеточных линий HT29, предварительно обработанных противораковыми агентами в течение 24 часов. Были проведены измерения исходного уровня OCR и ECAR, и клетки были последовательно обработаны 1 мкМ олигомицином (Cell Signaling), а затем 1 мкМ FCCP (Abcam). Количество клеток, использованное для нормализации, определяли путем фиксации планшета после анализа 4% параформальдегидом, окрашивания Hoechst, визуализации 4 квадрантов / лунку на Molecular Devices ImageXpress HCS и подсчета среднего количества ядер на квадрант.

Анализ данных

Изображения были проанализированы с помощью специального сценария, написанного на Acapella® (PerkinElmer Inc.). Сегментация изображения для идентификации ядер и вычисление интегральной интенсивности пикселей для каждого объекта в канале излучения Hoechst были выполнены с помощью оптимального модуля «обнаружения ядер». Затем количество клеток (ядер) нормализовали и выражали как процент от усредненного на планшете контроля ДМСО. Для анализа распределения клеточного цикла интегральная интенсивность флуоресценции Hoechst была сначала логарифмически трансформирована ₂ .Для каждого эксперимента сначала анализировали log ₂ гистограмм интенсивности из нескольких контрольных лунок с ДМСО для определения значения интенсивности, соответствующего центру 2N субпопуляции. Это значение затем применялось в качестве входного параметра для определения диапазона поиска точного пика 2N ДНК для каждой лунки и для нормализации интенсивности ДНК к этому значению, чтобы максимум 2N пика соответствовал 1, а центр 4N ДНК. пик соответствовал 2. Затем отдельные клетки были классифицированы в соответствии с содержанием ДНК; sub-G1 (log2 нормализованная интенсивность ДНК <0.75), 2N (0,75–1,25), S (1,25–1,75), 4N (1,75–2,5) и> 4N (> 2,5). Затем выводили процент клеток в каждой фазе на лунку. Что касается митохондриальных характеристик, окраска MitoTracker использовалась для определения цитоплазматической области вокруг каждого обнаруженного ядра с помощью модуля Acapella «обнаружение цитоплазмы», а также для определения площади, средней интенсивности и интегральной интенсивности для каждой клетки. Среднее значение интегрированных интенсивностей MitoTracker и TMRE для всего отображаемого поля в лунке было рассчитано, затем нормализовано и выражено как кратное изменение относительно усредненного на планшете контроля ДМСО.

Кривые доза-ответ для подсчета клеток, анализа АТФ и MTS анализировали с использованием модуля Condeseo программы Genedata Screener (GeneData AG). Стратегия робастной подгонки (двойного веса Тьюки) использовалась для подгонки данных к 4-параметрической логистической подгонке со следующими ограничениями: 20 <диапазон <100, 0,5 <уклон холма <4. Критерии приемлемости для допустимых подгонок: √χ ² / F <(1,5-кратное стандартное отклонение) и S.E. Журнал EC ₅₀ <1.

Результаты

Разработка и проверка анализа клеточного цикла и количества клеток

Чтобы изучить эффективность и механизмы действия соединений с прогнозируемыми антипролиферативными эффектами и эффектами, опосредованными клеточным циклом, мы оптимизировали процедуру окрашивания и визуализации фиксированных клеток с высокой пропускной способностью. Количественное определение мертвых / отделившихся, а также жизнеспособных клеток желательно при составлении профиля потенциально вызывающих апоптоз или цитотоксических агентов. С этой целью мы разработали протокол без каких-либо промывок или смены среды. Классификация фаз клеточного цикла была достигнута с помощью гистограммы ДНК, поэтому поддержание линейной зависимости между содержанием ДНК и интегральной интенсивностью ДНК было критически важным. Это было достигнуто с использованием мягкой детергентной проницаемости фиксированных клеток для облегчения равномерного окрашивания по Hoechst.

Чтобы убедиться, что количественное определение содержания ДНК было линейным, клетки HT29 обрабатывали лекарствами, индуцирующими специфические фенотипы остановки клеточного цикла, как показано на рисунке 1.Ингибитор киназы MEK, PD901, индуцировал остановку клеточного цикла в контрольной точке G1 / S (содержание ДНК 2N) за счет активации p27 и подавления циклина D1 [16], [17], антимитотический препарат паклитаксел вызывал остановку митоза (ДНК 4N), в то время как ингибитор киназы Aurora VX-680, который, как известно, вызывает эндоредупликацию [18], дал популяцию клеток с содержанием ДНК 8N. На фиг.1А показано, что для гистограмм интегральной интенсивности log2-трансформированной ДНК наблюдали ожидаемое двукратное (на одну единицу) увеличение интенсивности пика между центрами пиков 2N, 4N и 8N.«Золотым стандартом» определения содержания ДНК является проточная цитометрия; Данные сравнения, показанные на рисунке 1B, показывают, что основное различие заключается в расширении пиков 2N и 4N с интенсивностями, полученными из изображения, и, соответственно, в отсутствии отдельной промежуточной популяции S-фазы, однако, если одни и те же правила бинирования применяются к обоим наборам данных, частота субпопуляций в условиях контроля и лечения сравнима.

Рисунок 1. Анализ клеточного цикла с высоким содержанием.

клеток HT29, обработанных в течение 48 часов указанными обработками в 384-луночном планшете, фиксировали и окрашивали Hoechst 33452, визуализировали и оценивали интегральную интенсивность окрашивания отдельных ядер, как описано в разделе «Материалы и методы». А . Гистограммы содержания ДНК для log-2 значений интенсивности трансформированной ДНК, нормализованные к модальному значению 2N ДНК. Показана автоматическая классификация на подгруппы G1, 2N, S-фазы, 4N и 8N. В . Гистограммы содержания ДНК, полученные с помощью проточной цитометрии, необработанные данные FL2-A были нормализованы и объединены таким же образом, как и данные с высоким содержанием. С . Количественное определение фракций подгруппы населения на гистограммах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g001

Определение сложных механизмов действия на основе анализа клеточного цикла

Дозозависимые изменения количества клеток и распределения популяций клеточного цикла измеряли одновременно с помощью метода, описанного выше. Первоначальная валидация анализа использовала клетки HT29, обработанные в течение 48 часов. Эта клеточная линия была выбрана потому, что присутствие мутации B-Raf (V600E) дает возможность индуцировать цитостатическую остановку G1 с помощью ингибиторов киназы пути MAPK, а также потому, что их морфология подходит для анализа изображений (т.е.е. рост в виде монослоя с отдельными ядрами и цитоплазмой, надежно обнаруживаемыми с помощью автоматической сегментации изображений).

Был протестирован набор химиотерапевтических агентов и ингибиторов киназ с известной или прогнозируемой активностью в отношении определенных точек клеточного цикла, как показано в таблице 1. На рисунке 2A показаны дозозависимые изменения количества клеток и фракций популяции для подгруппы этих соединений. . Профили субпопуляций клеточного цикла для всех других протестированных соединений представлены на рисунке S1.

Рисунок 2. Профили клеточного цикла, полученные в результате анализа с высоким содержанием.

Клетки на тех же изображениях, которые использовались для прямого подсчета клеток, были разделены на пять интервалов клеточного цикла по интегрированной интенсивности ДНК. A. Сложенные столбики показывают относительные частоты субпопуляций при указанных концентрациях. Каждая полоса представляет собой среднее значение двух лунок. Черные кружки обозначают относительный номер ячейки. B. Гистограммы интегральной интенсивности ДНК, полученные из изображений из отдельных лунок, показывающие изменение профиля клеточного цикла от EC ₉₀ (верхние панели) до более высоких доз этопозида, гемцитабина и VX-680.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g002

Большинство соединений показали изменения профиля клеточного цикла в соответствии с ожидаемыми MoAs, совпадающими с уменьшением количества клеток. Например, паклитаксел индуцировал устойчивую остановку митоза (содержание ДНК 4N) в широком диапазоне концентраций. Аналогичные результаты были получены для другого препарата, стабилизирующего микротрубочки, эпотилона B, и для дестабилизирующих микротрубочки агентов нокодазола, колцемида и винбластина (рис. S1).

Однако ряд соединений, проиллюстрированных на фиг. 2 этопозидом, гемцитабином, VX-680 и BI-2536, показали дальнейшие изменения в профиле клеточного цикла при более высоких концентрациях, давая двухфазный ответ на дозу. Гистограммы содержания ДНК на фиг. 2В более подробно иллюстрируют переключение с профиля при ∼EC ₉₀ на ответ при более высоких концентрациях. При подсчете клеток EC ₉₀ этопозид показывает преобладающую задержку G2, тогда как при 62 мкМ наблюдается значительно большая гетерогенность и большая фракция суб-G1.В диапазоне 10–100 нМ гемцитабина преобладает популяция S-фазы, но при более высоких концентрациях гистограмма показывает сдвиг в сторону более ранней остановки в S-фазе. В то время как VX-680 является ингибитором Aurora A и B, фенотипический ответ обычно согласуется с ингибированием Aurora B [18]. Накопление клеток с содержанием ДНК 8N (и более высокой плоидностью), показанное на рисунках 1 и 2, является типичным. Снижение уровня АТФ и MTS на втором этапе совпало с изменением профиля клеточного цикла с преимущественно 8N на более крупные фракции 4N и суб-G1 (рис. 2B).В других случаях, когда происходило изменение доминирующего фенотипа при разных концентрациях, например цисплатин, стауроспорин и ингибитор киназы cMet / ALK кризотиниб [19] продемонстрировали переход от 4N ДНК (G2 или M) к значительной популяции суб-G1 (ядерная фрагментация / апоптоз) при более высоких тестовых концентрациях.

Сообщается, что ингибитор PLK1 BI-2536 вызывает остановку прометафазы с последующей митотической катастрофой и апоптозом в клетках HeLa и HCT116 [20] — [22]. В случае HT29 преобладала популяция 4N (прометафаза), но очень мало популяции суб-G1 в 48-часовой временной точке.

Ценность этого метода в обнаружении неожиданных нецелевых эффектов соединений была продемонстрирована наблюдением, что предполагаемый ингибитор киназы cMet ARQ-197 (тивантиниб) [23] ингибировал пролиферацию клеток и индуцировал остановку M-фазы (Рисунок S1), который не является фенотипом, ожидаемым для ингибирования cMet. Это наблюдение согласуется с недавним сообщением о том, что тивантиниб ингибирует полимеризацию тубулина [24].

Сравнение форматов анализов

Таким образом, анализ высокого содержания позволил провести прямое сравнение активности и эффективности соединения, как определено прямым подсчетом клеток против в анализах АТФ-зависимой люциферазы / люциферина и восстановления MTS.Также сравнивали анализ общей флуоресценции ДНК (CyQuant).

Для сравнения различных форматов анализа планшеты для репликации обрабатывали серийными разведениями каждого соединения в течение 48 часов. Были выполнены 20-точечные двукратные серийные разведения, чтобы гарантировать, что будет наблюдаться полный диапазон ответов. Затем один повторный планшет обрабатывали для каждого из стандартного анализа ATP CellTiter-Glo, колориметрического анализа MTS, CyQuant и анализа высокого содержания, как описано выше. Кривые «доза-ответ» для количества клеток и сигналов люциферазы, MTS и CyQuant анализировали путем подгонки к 4-параметрической логистической модели с неограниченными верхней и нижней асимптотами и соответствовали критериям приемлемости, как определено в разделе методов.EC ₅₀ (концентрация, дающая 50% максимального отклика) и E _max (максимальное снижение сигнала в процентах, определяемое нижней асимптотой аппроксимирующей кривой) значения из этих аппроксимаций кривых суммированы в таблице 1.

Как показано в таблице 1, степень соответствия между количеством клеток и результатами прокси-анализа на основе метаболизма значительно различалась между соединениями. В то время как значения EC ₅₀ , полученные из числа клеток, в большинстве случаев были сопоставимы с результатами анализа АТФ и MTS, агенты, нацеленные на синтез ДНК, были явным исключением.Кроме того, некоторые виды лечения (например, ингибиторы митотической киназы BI-2536 и VX-680) давали немонотонные кривые доза-ответ с анализами АТФ и MTS, которые не могли быть подогнаны к действительным кривым (см. Рисунок 3A), хотя количество клеток доза кривые отклика были хорошими.

Рисунок 3. Сравнение анализов АТФ и MTS с прямым подсчетом клеток.

Планшеты с репликами клеток HT29 обрабатывали, как указано, в течение 48 часов, затем анализировали с помощью анализа АТФ или MTS или подсчета клеток с высоким содержанием. A. Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки), анализа АТФ (RLU) (синие треугольники) и анализа MTS (E ₄₉₀ ) (зеленые квадраты), линии указывают на соответствие 4-параметрической логистической модели. Если линия не отображается, то регрессия не привела к получению кривой, соответствующей критериям приемлемости. B. Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки) и анализа ДНК (CyQuant) (синие треугольники) C. Кратное изменение нормализованных соотношений сигнала ATP RLU к числу клеток (зеленые квадраты) и сигнала анализа MTS к номер ячейки (синие треугольники) D. Кратное изменение нормализованного отношения сигнала анализа ДНК к количеству клеток.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g003

Эффективность, или E _max , результаты показали большие различия, чем значения EC ₅₀ между форматами анализа для многих видов лечения. Обычно, хотя количество клеток снижалось примерно на 80% при максимально эффективных концентрациях, было значительно меньшее снижение сигнала АТФ и MTS; например, все агенты, нацеленные на микротрубочки, дали значения E _max в диапазоне снижения на 45-60%.В крайних случаях афидиколина и гемцитабина снижение сигнала АТФ и MTS было недостаточным для достоверного соответствия кривой, несмотря на уменьшение числа клеток на ~ 80%.

Кривые доза-ответ для выбранных соединений, которые показали значительные различия между анализами, представлены на рисунках 3A и 3B. Отклонения между количеством клеток и сигналами анализа АТФ или MTS (рисунок 3C) и общей ДНК (рисунок 3D) показаны как кратное изменение нормализованного отношения сигнала к количеству клеток. Кривые для других соединений, перечисленных в таблице 1, представлены на рисунке S2.Гемцитабин, аналог нуклеозида, и этопозид, ингибитор топоизомеразы II, наряду с афидиколином и цисплатином, которые также ингибируют репликацию ДНК, представляют собой класс соединений, которые показали наиболее разительные расхождения между анализами. Кривые АТФ и MTS для этопозида были смещены вправо более чем в 10 раз относительно количества клеток, но сходились к аналогичному значению E _max при максимальной концентрации. Таким образом, соотношение АТФ и MTS на клетку показало колоколообразный ответ с максимальным увеличением в 4-5 раз.Гемцитабин индуцировал увеличение АТФ и MTS на клетку аналогичной величины, но в этом случае повышение было постоянным, а кривые ATP и MTS не уменьшались или не сходились с числом клеток вплоть до самой высокой испытанной концентрации (25 мкМ).

Расхождения между различными кривыми доза-ответ для паклитаксела (рис. 3) и других лекарственных средств, нацеленных на микротрубочки (рис. S2), были не такими значительными, как для средств нацеливания на ДНК. В то время как EC ₅₀ s для кривых MTS и ATP не сдвигались относительно количества клеток, значения E _max были значительно меньше (45% и 55% соответственно), чем уменьшение абсолютного количества клеток на 85%.Это соответствовало 2-кратному увеличению АТФ / клетка и MTS / клетка.

PD901, который вызывает фенотип остановки G1, дал кривые числа клеток и АТФ, которые полностью накладывались друг на друга, однако кривая MTS была значительно более пологой, что соответствовало приблизительно 2-кратному увеличению отношения MTS / клетки. Снижение абсолютного числа клеток было меньше для этого лечения, чем для других, которые также были цитостатическими. Это согласуется с тем фактом, что PD901 ингибирует деление клеток при переходе G1 / S, таким образом, любые клетки в S, G2 или M-фазе во время воздействия препарата завершат одно удвоение до остановки.

Эффекты двух ингибиторов митотической киназы, VX-680 и BI-2536, также показаны на рисунке 2. Кривые количества клеток показали монотонное уменьшение, позволяющее надежно определить ЕС ₅₀ , но кривые доза-ответ АТФ были значительно больше. сложный. VX-680 давал двухэтапное двухфазное снижение с начальным снижением при концентрации, аналогичной ответу числа клеток, с последующим плато с эффектом ~ 30% перед вторым снижением. С другой стороны, сигнал MTS не уменьшался до той же концентрации, что и на втором этапе кривой АТФ.Ингибитор PLK1 BI-2536 также давал кривые зависимости реакции от дозы АТФ и MTS, которые значительно отличались от числа клеток и поражали своей сложностью. Оба анализа показали многофазные кривые «доза-ответ» (рис. 3), где начальное уменьшение сигнала соответствовало ответу числа клеток, за которым следовало увеличение перед повторным падением при более высоких концентрациях.

Данные, полученные с использованием сигнала общей флуоресценции ДНК (CyQuant), также сравнивали с прямым подсчетом клеток. В отличие от двух других прокси-анализов, на этот сигнал анализа не должны влиять изменения размера клеток или метаболической активности.Присутствие непроницаемого для клеток тушащего реагента ограничивает анализ обнаружением только клеток с неповрежденными плазматическими мембранами. Рисунок 3B показывает, что для того же набора соединений было значительно меньше расхождений с числом клеток, чем прокси-анализы, основанные на метаболизме. Однако некоторые виды лечения, например этопозид, паклитаксел и VX680, по-прежнему вызывали значительные различия в значениях E _max между числом клеток и сигналом CyQuant. Эти различия полностью согласуются с изменениями среднего отношения ДНК / клетки, ожидаемыми для накопления клеток с содержанием ДНК 4N или 8N, представленных как нормализованное соотношение на рисунке 3D.

Подобные эффекты наблюдаются на нескольких линиях ячеек

Мы также хотели определить, можно ли распространить эти изменения на большее количество клеточных линий. Набор соединений, которые показали значительные отклонения в формате между анализами, анализировали параллельно в анализах с высоким содержанием АТФ и MTS, как описано выше, с использованием 5 дополнительных клеточных линий; A375 (BRafV600E, p53wt), A549 (k-ras G12Sp53 wt), HCT116 (k-Ras G12D, p53 wt, PI3Ka h2047R), DLD1 (K-Ras G13D, p53-mut) и NCI-h2299 (N-Ras Q61K , p53-нуль).

Кривые доза-ответ для количества клеток, анализов АТФ и MTS для гемцитабина, этопозида, VX-680 и BI-2536 показаны на рисунке 4. Результаты подбора кривой (EC ₅₀ и E _max ) для этих и других соединений. приведены в таблице S1). Результаты для этопозида аналогичны HT29 для всех линий; Наиболее существенное различие между анализами АТФ и MTS и прямым подсчетом клеток — это недооценка эффективности (т.е. кривые, сдвинутые вправо). DLD-1 отличается большим сдвигом и более значительным повышением сигнала MTS, чем АТФ.Однако во всех случаях сигналы ATP и MTS достигают такого же значения E _max , что и количество ячеек. Гемцитабин по-разному влиял на соотношения АТФ / клетка и MTS / клетка в разных клеточных линиях. A549, A375 и HCT116, которые относятся к р53-дикому типу, показали 5-10-кратные сдвиги в EC ₅₀ , с кривой E _max , близкой к количеству клеток E _max — это соответствует временному увеличению АТФ / ячейка и МТС / ячейка. DLD1 и h2299, которые, как и HT29, являются p53-нулевыми, демонстрируют повышенные на клетку АТФ и MTS во всем диапазоне эффективных концентраций (7 нМ –25 мкМ) и, таким образом, значительно меньше E _max .Другой протестированный ингибитор синтеза ДНК, Афидиколин, показал аналогичное различие в АТФ и MTS E _max между линиями клеток p53-wt и p53-null (Таблица S1).

Рисунок 4. Сравнение анализов АТФ и MTS с прямым подсчетом клеток для нескольких клеточных линий.

Планшеты с репликами клеток обрабатывали, как указано, в течение 48 часов, затем анализировали с помощью анализа АТФ или MTS или подсчета клеток с высоким содержанием. Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки), анализа АТФ (RLU) (синие треугольники) и анализов MTS (E ₄₉₀ ) (зеленые квадраты), линии указывают на соответствие 4-параметрической логистической модели.Если линия не отображается, значит, регрессия не привела к кривой, отвечающей критериям приемлемости.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g004

Клеточные ответы на VX-680 согласуются с данными HT29, обсужденными выше. Во всех случаях кривые АТФ и MTS показывают небольшое начальное снижение при тех же концентрациях, что и количество клеток, из-за увеличения сигнала АТФ и MTS на клетку. Профили клеточного цикла показывают такое же двухфазное накопление 8N, а затем 4N фракций при возрастающих концентрациях, как описано выше для HT29 (данные не показаны).Ингибитор PLK1 BI-2536 индуцировал тот же тип аберрантных кривых АТФ и MTS, описанных выше для HT29, со всеми линиями клеток, кроме HCT116 и h2299. Как суммировано в таблице S1, достоверные соответствия не могли быть получены для 4/6 клеточных линий с помощью анализа MTS.

Одновременное определение митохондриальной массы, количества клеток и распределения клеточного цикла

Наблюдаемое увеличение АТФ на клетку означает либо увеличение размера клетки (объема цитоплазмы) при постоянной концентрации АТФ, либо вызванное лекарством увеличение концентрации АТФ и метаболической активности.Чтобы измерить как метаболическую (АТФ) способность, так и размер клеток, мы расширили наш протокол анализа с высоким содержанием, включив окрашивание красителем MitoTracker Deep Red, который накапливается в активных митохондриях и сохраняется при фиксации и мягкой проницаемости детергента [25] , [26]. Таким образом, мы смогли количественно оценить митохондриальную массу вместе с содержанием ДНК для каждой клетки.

Эффекты выбранных соединений проиллюстрированы на рисунке 5. Репрезентативное изображение окрашенных MitoTracker клеток из одной из тех же лунок, использованных для получения данных, показано на рисунке 5A.На рис. 5В показано количественное определение массы митохондрий в зависимости от содержания ДНК. Каждое изображение и график были получены из лунок, обработанных концентрациями, наиболее близкими к числу клеток EC ₉₀ . В некоторых случаях очевидно резкое усиление окрашивания и морфологии MitoTracker, вызванное лекарственными препаратами. Увеличение митохондриальной массы может быть связано либо с большей плотностью (например, митохондриальной пролиферацией), либо с увеличением размера клеток при сохранении постоянной плотности. Рисунок 5C показывает, что последний случай был очевиден с четкой корреляцией между площадью клеток, определенной с использованием фонового окрашивания MitoTracker, и интегральной интенсивностью MitoTracker.Данные для других протестированных соединений представлены на рисунке S3.

Рис. 5. Влияние обработки соединением на массу митохондрий и размер клеток.

Клетки

HT29 обрабатывали указанными препаратами в течение 48 часов. (Афидиколин; 3,1 мкМ, этопозид; 3,9 мкМ, гемцитабин; 24 нМ, паклитаксел; 98 нМ, VX-680; 195, нМ, PD901; 390 нМ). A. Изображения ДНК, окрашенной Hoechst 33452 (красный) и окрашивания MitoTracker темно-красным-FM (зеленый) были получены с помощью 20-кратного погружения в воду, как описано в разделе «Методы».Все изображения показаны с одинаковым увеличением и масштабированием интенсивности. Шкала шкалы = 50 мкм. B. MitoTracker — темно-красные изображения, показывающие идентификацию и сегментацию границ ячеек. C. Диаграммы разброса и гистограммы интегрированной интенсивности ДНК, нормализованной по log2 (ось x, верхние панели гистограмм), и интегрированной интенсивности цитоплазматического окрашивания MitoTracker Deep Red FM (ось y, гистограммы справа), полученные из тех же лунок, что частично показаны A. D. Вариация площади клеток и содержания митохондрий (интегрированная интенсивность темно-красного цвета MitoTracker) для одних и тех же популяций клеток, нормализованная как кратное изменение относительно средней площади и интенсивности образцов, обработанных ДМСО.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g005

Лечение этопозидом и гемцитабином привело к образованию клеток с большими неконденсированными ядрами, профили содержания ДНК соответствовали остановке на контрольной точке повреждения ДНК G2 для первого и во время S -фаз для последнего. Ингибитор Aurora B VX-680 индуцировал большие многодольчатые ядра, преимущественно с содержанием ДНК 8N. Эти механизмы остановки клеточного цикла также были связаны со значительным увеличением площади цитоплазмы и общей площади клеток, что соответствовало увеличению содержания митохондрий.Графики зависимости площади клетки от содержания митохондрий для других тестируемых соединений, представленные на рисунке S2, показывают, что другие соединения, которые увеличивают размер клеток; афидиколин, BI-2536, доксорубицин, также вызывал пропорциональное увеличение митохондриального содержания. Хотя паклитаксел и другие нацеленные на микротрубочки агенты также вызывали стойкую остановку митоза, не наблюдалось ни увеличения средней площади клеток, ни содержания митохондрий. Клетки, задержанные в G1 с помощью PD901, не имели значительных изменений в интенсивности окрашивания MitoTracker по сравнению с контролями DMSO.

Ранее было продемонстрировано, что митохондрии пролиферируют непрерывно и асинхронно на протяжении клеточного цикла для поддержания постоянной митохондриальной массы на клетку при каждом клеточном делении [27], поэтому ожидается, что клетки в G2 и M-фазе будут иметь большее количество митохондрий, чем G1. клетки. Данные на рисунке 5B позволили нам оценить, было ли увеличение активности АТФ и MTS на клетку просто следствием увеличения доли более крупных клеток G2 / M. Однако, хотя клетки 4N в необработанных образцах показали некоторое увеличение интегрированной интенсивности MitoTracker по сравнению с популяцией 2N, они все же имели значительно более низкую интегральную интенсивность, чем индуцированные этопозидом 4N и индуцированные гемцитабином клетки с задержанной S-фазой.Таким образом, накопление митохондриальной массы и АТФ является специфической реакцией на медикаментозное лечение.

Увеличение массы митохондрий, вызванное лекарственными средствами, коррелирует с изменениями соотношения АТФ: клетки

Затем мы попытались определить, существует ли количественная взаимосвязь между увеличением массы митохондрий и изменениями в соотношении АТФ / клетка и MTS / клетка. Прямое сравнение средней интегрированной интенсивности MitoTracker на клетку с сигналом анализа АТФ на клетку для клеток HT29, обработанных этопозидом и гемцитабином, представлено на рисунке 6A.Этот график показывает, что дозозависимые увеличения обоих значений для каждой клетки сильно коррелированы. В случае гемцитабина, как видно из графиков кривой доза-ответ, оба значения увеличиваются до плато. Этопозид, однако, показывает коррелированное увеличение и последующее уменьшение обоих значений при увеличении концентрации, что отражает двухфазные или колоколообразные кривые зависимости реакции от дозы и двухфазный механизм действия этого препарата.

Рисунок 6. Индуцированное лекарством увеличение митохондриальной массы коррелирует с увеличением сигнала анализа АТФ на клетку и MTS.

A. Корреляция между АТФ / клеткой (RLU / количество клеток) и средней интегрированной интенсивностью MitoTracker на клетку для каждой точки кривых доза-ответ. Каждая точка является средним значением для повторяющихся лунок. Цвета указывают относительные концентрации в 2-кратных разведениях от самого высокого (красный) до самого низкого (синий). Очки соединяются в порядке концентрации. B, C Верхние панели показывают кратное изменение средней интегрированной интенсивности окрашивания MitoTracker на клетку в зависимости от концентрации. На нижних панелях показаны кривые доза-ответ для общей массы митохондрий (количество клеток, умноженное на среднюю интенсивность MitoTracker для каждой клетки) (фиолетовый), наложенные на данные анализа АТФ (синий). B. Клетки HT29, обработанные указанными соединениями. C. Различные линии клеток, как указано, обработанные гемцитабином.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g006

На рис. 6В на верхних панелях нанесена интенсивность MitoTracker на клетку для клеток HT29, обработанных указанными соединениями. Данные об интенсивности MitoTracker были получены из тех же образцов, что и данные о количестве клеток и клеточном цикле на рисунках 3 и 5. Чтобы установить, было ли увеличение митохондриальной массы на клетку достаточным для объяснения изменений отношения общего АТФ к количеству клеток , общую митохондриальную массу на лунку рассчитывали путем умножения количества клеток на среднюю интенсивность MitoTracker на клетку.Построение этого значения дало кривые доза-ответ для общей массы митохондрий на лунку, которые близко соответствуют сигналу АТФ на лунку (нижние панели, рисунок 6B).

Такой же анализ представлен на фиг. 6C для пяти других клеточных линий, обработанных гемцитабином. Зависящие от клеточной линии вариации ответа АТФ в зависимости от количества клеток отражаются изменениями общей митохондриальной массы на лунку.

Результаты EC ₅₀ и E _max для общих кривых зависимости массы митохондрий от дозы на лунку, показанных здесь, и для восьми соединений, протестированных против всех шести клеточных линий, включены в таблицу S1 вместе с клеткой. количество, данные анализа АТФ и MTS.Результаты по общей массе митохондрий хорошо согласуются с результатами анализа АТФ.

Изменения митохондриальной активности, вызванные лекарственными средствами

На изменение содержания АТФ в клетках может влиять не только размер клеток, но и изменения дыхательной активности. Поэтому мы проверили, коррелирует ли увеличение уровня АТФ на клетку с повышением метаболической активности при лечении, которое вызывало или не вызывало соответствующие изменения в составе митохондрий. Клетки HT29, обработанные в течение 24 часов выбранными соединениями, анализировали на скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR), показатель гликолитической активности.Затем эти значения были нормализованы по количеству ячеек (рисунок S4). Повторные планшеты анализировали на содержание АТФ, количество клеток, размер клеток и массу митохондрий, как описано выше, однако митохондрии также окрашивали чувствительным к мембранному потенциалу красителем TMRE, чтобы проверить, влияет ли лечение лекарствами на ΔΨ.

Базовые данные OCR, нормализованные для каждой клетки, нанесены на график относительно содержания АТФ и митохондрий на клетку на рисунках 7A и 7B. Для этопозида, гемцитабина и VX-680 изменения OCR для каждой клетки очень похожи на изменения размера клеток и митохондриальной массы, тогда как потенциал митохондриальной мембраны существенно не изменяется (что определяется отношением TMRE к интенсивности темно-красной флуоресценции MitoTracker). (Рисунок 7C).Это согласуется с гипотезой о том, что увеличение АТФ на клетку для этих классов соединений связано с увеличением размера клеток и митохондриальной массы, а не с изменениями митохондриальной функции. Не было изменений и в соотношении окислительного и гликолитического метаболизма. Паклитаксел, с другой стороны, индуцировал значительное увеличение АТФ / клетку, как описано выше, без какого-либо увеличения метаболической активности (как OCR, так и ECAR были немного снижены в расчете на клетку). PD901 оказал неожиданный эффект значительного подавления OCR, несмотря на отсутствие заметного влияния на митохондрии или содержание АТФ.

Рисунок 7. Влияние медикаментозного лечения на функцию митохондрий.

Скорость базального потребления кислорода (OCR), определенная для клеток, обработанных указанными соединениями (этопозид, 10 мкМ; гемцитабин 0,1 мкМ; паклитаксел 0,01 мкМ; PD901 1 мкМ, VX-680 0,2 мкМ), нормализовали по количеству клеток. Для каждой клетки OCR сравнивается с нормализованными АТФ-генерируемыми RLU ( A ) и митохондриальной массой ( B ). Клетки, проанализированные на митохондриальную массу с помощью окрашивания MitoTracker Deep Red, также окрашивали потенциально чувствительным красителем TMRE митохондриальной мембраны и сравнивали средние интегральные интенсивности ( C ).Все данные были нормализованы как отношение средних значений, обработанных ДМСО, и представляют собой среднее значение для четырех повторных лунок, полосы ошибок показывают стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g007

Зависимость от времени вариации формата анализа

Время обработки 48 часов было выбрано для вышеуказанных исследований, поскольку оно соответствует ~ 2-3 удвоениям для большинства клеточных линий, таким образом, начального количества клеток достаточно для получения надежных данных о подсчете клеток в присутствии цитостатических препаратов. без необработанных клеток, достигающих слияния.Чтобы исследовать степень, в которой разрыв связи АТФ / клетки зависит от времени, реплицируемые планшеты анализировали в разное время с использованием этопозида и гемцитабина. Поскольку мутационный статус р53 потенциально является основным детерминантом кинетики и характера ответа на лечение лекарственными средствами, нацеленными на ДНК, мы исследовали клетки A375 (p53 wt), а также HT29 (p53-нулевые) клетки. Для поддержания подходящей плотности клеток в конечной точке анализа планшеты засевали с разной плотностью, затем обрабатывали в течение 24, 48 и 72 часов перед обработкой для визуализации и анализов АТФ.

EC ₅₀ и E _max данные по дозозависимости АТФ и подсчету клеток при разном времени лечения суммированы на фигуре 8A. На фиг. 8B и 8C показаны соответствующие кривые зависимости зависимости от дозы для этопозида и гемцитабина. С увеличением времени наблюдается значительно лучшее схождение кривых числа клеток и АТФ, с увеличением значений АТФ-анализа E _max и некоторым сдвигом кривых влево. Для сравнения, значения количества клеток EC ₅₀ были относительно постоянными, в то время как значения E _max увеличивались со временем.Примечательно, что клетки HT29, обработанные в течение 24 часов гемцитабином или этопозидом, показывают увеличение сигнала анализа АТФ по сравнению с контролем. В то время как через 48 часов не было достаточного снижения сигнала анализа HT29 ATP, чтобы дать значение EC ₅₀ , ответ HT29 ATP был аналогичен ответу A375 через 72 часа. Конвергенция и увеличение Emax для гемцитабина были связаны с увеличением фракции суб-G1 (фигура 8E), что предполагает зависящее от времени прогрессирование от остановки клеточного цикла к апоптозу.Для A375 фракция суб-G1 через 48 часов была больше, чем у клеток HT29, что соответствовало меньшей разнице между АТФ и количеством клеток.

Рис. 8. Зависимость от времени расхождений между количеством клеток и анализом АТФ.

A. Значения ЕС ₅₀ и E _max Клетки HT29 и A375, обработанные этопозидом или гемцитабином в течение указанных периодов времени, анализировали с помощью АТФ и анализов с высоким содержанием, как описано. ND, не определено — не удалось подобрать действительную кривую в соответствии со стандартными критериями приемлемости, описанными в методах.Анализируемые кривые доза-ответ ( B, C ) и профили клеточного цикла ( D, E ) для клеток A375 и HT29, обработанных этопозидом ( B, D ) и гемцитабином ( C, E ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.g008

Обсуждение

Мы стремились разработать высокопроизводительный тест для изучения как антипролиферативной активности, так и механизма действия лекарств, нацеленных на клеточный цикл. Высокопроизводительная микроскопия позволяет проводить прямой подсчет клеток.Оптимизация условий подготовки образцов (фиксация, проницаемость и окрашивание) и анализ изображений позволили провести одноэтапный анализ без отмывки, который также является количественным для определения содержания ДНК и, следовательно, распределения клеточного цикла. Окрашивание MitoTracker потребовало только дополнительного этапа добавления реагента, поскольку конфокальная визуализация практически устраняла фоновую флуоресценцию. Устранение каких-либо требований к этапам аспирации или промывки также значительно облегчит реализацию этого анализа в 1536-луночном формате.

Более сложные методы обнаружения и анализа (например, иммуноокрашивание белков и фосфоэпитопов, регулируемых клеточным циклом, множественная морфология ядра, параметры текстуры и интенсивности) были использованы для идентификации субпопуляций клеточного цикла с помощью анализа высокого содержания (например [28 ] — [34]). Однако мы решили использовать монопараметрическое объединение содержимого ДНК по нескольким причинам. Одна из ключевых задач оптимизации протокола без промывки заключалась в том, чтобы гарантировать, что все клетки, включая отделенные и фрагментированные апоптотические клетки, сохраняются, поэтому иммуноокрашивание невозможно.Дифференцировать G2 от М-клеток на основе морфологии ядра можно с помощью измеренного нами параметра анализа на уровне клеток (см., Например, [22]), но во многих случаях лечение соединениями приводит к аномальной морфологии, которая не соответствует ни одной из обнаруженных популяций. в необработанных клетках.

Сравнение прямого подсчета клеток с двумя обычно используемыми анализами «пролиферации», основанными на клеточном метаболизме; Содержание АТФ и активность редуктазы MTS выявили общий и значительный артефакт, заключающийся в том, что в условиях остановки клеточного цикла предполагаемая линейная зависимость между сигналом анализа и количеством клеток нарушается.Среднее количество АТФ (как следует из повышенной биолюминесценции люциферазы / люциферина) или MTS-снижающей активности на клетку значительно увеличивается. Это увеличение коррелирует с увеличением размера клетки на клетку и, следовательно, митохондриального содержания, и может быть объяснено этим.

Для сравнения, оценка количества жизнеспособных клеток с использованием общей флуоресценции ДНК (анализ CyQuant) была менее склонна к отклонению от фактического количества клеток. В предыдущих исследованиях также сообщалось о различиях в определении количества клеток между количественной оценкой ДНК и анализами, основанными на метаболизме [1], [35], [36].Однако методы лечения, которые значительно изменяли среднее содержание ДНК на клетку, вызывая остановку митоза и / или эндоредупликацию, также приводили к недооценке процентного изменения числа клеток с помощью анализа CyQuant.

В целом, изменения клеточного содержания АТФ и активности MTS приводили к одному из двух типов отклонений между количеством клеток и анализом ATP / MTS. Во-первых, были случаи, когда E _max был сильно уменьшен, то есть очень пологие кривые доза-реакция. Например, гемцитабин снижает сигнал АТФ для клеток HT29 примерно на 20%, тогда как на самом деле количество клеток уменьшилось на 80% по сравнению с контролем.Другая ситуация иллюстрируется этопозидом, где EC ₅₀ сдвинут вправо, но кривые доза-реакция сходятся к аналогичному E _max при достаточно высокой концентрации. Это могло привести к недооценке антипролиферативной активности в 10 и более раз. VX-680 представляет собой промежуточный случай, когда имеется двухфазная кривая АТФ с промежуточным плато, соответствующим повышенному соотношению АТФ / клетки, за которым следует второе снижение. Такие кривые плохо подходят, если вообще соответствуют, стандартной 4-параметрической модели и могут привести к очень противоречивым результатам с точки зрения как EC ₅₀ , так и E _max .

Эти разные профили ответа можно объяснить механизмами действия этих соединений: существует двухфазная доза-реакция клеточного цикла на многие из этих препаратов. Во-первых, антипролиферативные или цитостатические ответы на мишени совпадают с уменьшением абсолютного числа клеток, но с небольшой гибелью клеток. В этих условиях арестованные клетки увеличиваются в размерах и митохондриальном содержании, и, соответственно, увеличивается количество АТФ на клетку. При более высоких концентрациях лекарственного средства популяционный фенотип может стать менее исключительно цитостатическим, в зависимости от клеточной линии и времени лечения.С увеличением фракции позднего апоптоза (суб-G1) средняя интенсивность MitoTracker и АТФ и MTS на клетку снижается. Например, для клеток HT-29 афидиколин и гемцитабин приводили к остановке S или G2 и повышению содержания митохондрий и АТФ на клетку в широком диапазоне концентраций, тогда как линии клеток p53 дикого типа A375 и A549 претерпевали фенотипическое переключение при более высоких концентрациях гемцитабина. , где значительно увеличенная апоптотическая фракция коррелировала с меньшим средним уровнем АТФ на клетку.Этопозид, с другой стороны, вызывал повышение активности АТФ и MTS и митохондриальной массы в ограниченном диапазоне концентраций во всех тестируемых клеточных линиях. Это согласуется с двухфазными механизмами действия, ранее наблюдавшимися для этих препаратов [37], [38]: при более низких концентрациях восстанавливаемое повреждение ДНК вызывает остановку на поздней стадии S или в контрольной точке G2 с минимальным апоптозом и, таким образом, накоплением митохондрий, АТФ и MTS. активность на ячейку. При более высоких концентрациях повреждение ДНК накапливается быстрее и повсеместно, вызывая остановку и апоптоз раньше в S-фазе.Подобный образец двухфазного ответа объясняет двухступенчатые кривые, наблюдаемые с VX-680, где преобладающий фенотип переключается с цитостатической эндоредупликации на преимущественно остановку 4N и гибель клеток, возможно, связанных с активностью вне мишени, при более высоких концентрациях.

Поведение теста MTS в случае ингибитора MEK PD901 необычно тем, что уровень активности MTS-дегидрогеназы на клетку увеличивается, но количество АТФ на клетку не изменяется под действием лекарственного средства.Однако другие ингибиторы киназ; VX-680, BI-2536 и кризотиниб также вызвали большее несоответствие между анализом MTS и количеством клеток, чем АТФ. Аналогичное наблюдение было зарегистрировано для иматиниба [39], генистеина [40] и фаслодекса [41]. Последние две статьи также продемонстрировали повышенную митохондриальную активность и митохондриальную массу. Поскольку существует множество механизмов и клеточных локализаций активности тетразолийредуктазы [5], наблюдение, что некоторые виды лечения в этом исследовании могут привести к разрыву связи между изменениями в митохондриальной массе и снижением MTS (например,грамм. PD901) не является неожиданным. Механизм двухфазной индукции под действием BI-2536 митохондриальной массы, АТФ и активности MTS при концентрациях, превышающих полностью эффективные антипролиферативные концентрации, явно отличался от других ингибиторов киназ и требует дальнейшего изучения.

Имеется ряд сообщений о химиотерапевтических средствах, вызывающих увеличение массы митохондрий, включая доксорубицин [10] и этопозид [9], [13], [42]. Было предложено несколько различных механизмов для объяснения этого увеличения.Fu et al [9] предположили прямую механистическую связь, при которой активированный ATM фосфорилирует и активирует AMPK, тем самым увеличивая митохондриальный биогенез. McGowan et al [41] продемонстрировали, что индукция остановки клеточного цикла за счет принудительной экспрессии p14ARF приводит к увеличению митохондриальной массы.

Стоит отметить, что ни в одном из вышеупомянутых отчетов размер клеток не рассматривался как фактор изменений в митохондриальном составе, и поэтому не было возможности дифференцировать специфическое увеличение митохондриального биогенеза от исходной митохондриальной пролиферации, продолжающейся в отсутствие клеточного деления.Последний механизм кажется правдоподобным для многих агентов, описанных в данном исследовании. Подобное наблюдение было недавно опубликовано Китами и др. [43], [44], где было показано, что многие соединения, идентифицированные при скрининге на увеличение митохондриальной массы, соответственно увеличивают размер клеток.

Также было сообщение о нацеленных на микротрубочки лекарствах, влияющих на функцию митохондрий посредством регуляции активности VDAC и ΔΨ уровнями свободного тубулина [11]. В текущем исследовании мы также наблюдали увеличение содержания АТФ, несмотря на небольшое снижение респираторной активности (как OCR, так и ECAR) в клетках, обработанных паклитакселом.Однако мы наблюдали увеличение клеточных уровней АТФ на E _max в ответ на лекарства, стабилизирующие и дестабилизирующие микротрубочки, что позволяет предположить, что уровень свободного тубулина не является причиной. Наши данные предполагают, что агенты, нацеленные на микротрубочки, увеличивают уровень АТФ в каждой клетке посредством механизма, который не связан с изменениями размера клеток, в отличие от агентов, нацеленных на синтез ДНК, и ингибиторов митотической киназы.

В то время как изменения дыхательной функции и потока четко контролируют скорость синтеза АТФ, менее ясно, когда, если вообще, изменения потока приводят к изменениям в установившейся концентрации АТФ, которая обычно находится под жестким контролем обратной связи [45].Связь между массой митохондрий, мембранным потенциалом и клеточными уровнями АТФ также может быть затруднена из-за вариаций вклада гликолиза во внутриклеточный пул АТФ [46], [47], однако, за исключением PD901, мы не наблюдали изменений в OCR / ECAR соотношение.

Таким образом, представляется, что существует несколько механизмов, с помощью которых различные соединения могут давать противоречивые и вводящие в заблуждение результаты в прокси-анализах, основанных на энергетическом метаболизме, однако изучение конкретных механизмов выходит за рамки настоящего исследования.

Это исследование также подчеркивает тот факт, что сложные механизмы действия и фенотипические реакции часто не подчиняются монотонному поведению доза-реакция. Соответственно, расхождения между абсолютным числом клеток и сигналами анализа АТФ или MTS могут сильно варьироваться в зависимости от тестируемой концентрации. Когда в прокси-анализах наблюдаются немонотонные кривые без оценки основных механизмов действия, не только ухудшается качество данных EC ₅₀ , но также отбрасывается ценная информация о механизме действия.Также существует потенциальный значительный риск ложноотрицательных результатов при использовании анализов АТФ или MTS для скрининга соединений на антипролиферативную активность или клеточных линий на чувствительность к соединениям, особенно если составные механизмы действия и воздействия на клеточный цикл, метаболическую активность и выживание недостаточно изучены. Мы показываем, что увеличение времени обработки соединения может уменьшить разницу между показаниями прокси-анализа и фактическим числом клеток, позволяя большему количеству клеток перейти к апоптозу.Однако это происходит за счет потери информации МСХ. Дополнительное обоснование комплементарности анализа абсолютного количества клеток и метаболических прокси-анализов демонстрируется путем определения зависимых от дозы, соединения и клеточной линии изменений значения АТФ / клетки, что может дать дополнительное понимание сложных механизмов действия. .

Высококачественная визуализация, даже просто путем окрашивания ДНК, таким образом, не только дает более точную информацию о количестве жизнеспособных клеток, но также предоставляет множество параметров, которые позволяют лучше понять сложный механизм действия и неоднородность ответа.Простота процедуры окрашивания и отсутствие стадий отмывки также делает этот подход очень подходящим для высокопроизводительного скрининга и профилирования соединений как в 384-, так и в 1536-луночном формате.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Профили клеточного цикла «доза-ответ». Клетки на тех же изображениях, которые использовались для прямого подсчета клеток, были разделены на пять интервалов клеточного цикла по интегрированной интенсивности ДНК. Столбики с накоплением показывают относительные частоты подгрупп населения при указанных концентрациях.Каждая полоса представляет собой среднее значение двух лунок. Черные кружки обозначают относительный номер ячейки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s001

(TIFF)

Рисунок S2.

Кривые доза-ответ для количества клеток, сигналов анализа АТФ и MTS. Планшеты с репликами клеток HT29 обрабатывали, как указано, в течение 48 часов, затем анализировали с помощью анализа АТФ или MTS или подсчета клеток с высоким содержанием. А . Нормализованные значения для прямого числа клеток (красные кружки), анализа АТФ (RLU) (синие треугольники) и анализов MTS (E ₄₉₀ ) (зеленые квадраты), линии указывают на соответствие 4-параметрической логистической модели.Если линия не отображается, то регрессия не привела к получению кривой, соответствующей критериям приемлемости.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s002

(TIFF)

Рисунок S3.

Сравнение площади клеток и содержания митохондрий для клеток, обработанных лекарством. Вариация площади клеток и содержания митохондрий (интегрированная интенсивность темно-красного цвета MitoTracker) для одних и тех же популяций клеток, нормализованная как кратное изменение относительно средней площади и интенсивности образцов, обработанных ДМСО.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s003

(TIFF)

Рисунок S4.

Метаболические эффекты медикаментозного лечения. Клетки HT29 обрабатывали указанными соединениями ((этопозид, 10 мкМ; гемцитабин 0,1 мкМ; паклитаксел 0,01 мкМ; PD901 1 мкМ, VX-680 0,2 мкМ) в течение 24 часов перед анализом скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного подкисления. (ECAR) с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse XF96. Базовые уровни (черный) определяли в указанные моменты времени перед добавлением олигомицина (зеленый), а затем FCCP (красный).Данные по скорости нормализованы по количеству клеток на лунку, определенному с помощью пост-анализа изображений с высоким содержанием.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s004

(TIFF)

Таблица S1.

Сравнение результатов анализа между форматами для панели клеточных линий. LogEC ₅₀ и E _max данные, определенные прямым подсчетом клеток, анализами АТФ и MTS и оценкой митохондриальной массы на лунку (Mito) для указанных препаратов и клеточных линий. Цветовые шкалы показывают отклонение от количества клеток EC ₅₀ , а абсолютное значение E _max .Нет данных, достоверные аппроксимации кривой не могут быть получены согласно критериям, описанным в разделе «Материалы и методы».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0063583.s005

(EPS)

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить внутренних и внешних рецензентов за их проницательные и конструктивные отзывы, Питера Тана за помощь в автоматизации и Джошуа Боумана за полезные обсуждения биогенеза и функции митохондрий.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: GKYC TLK DPP JGM.Проведены эксперименты: GKYC TLK DP. Проанализированы данные: GKYC DP JGM. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JM. Написал статью: GKYC JGM.

Ссылки

1. 1. Quent VMC, Loessner D, Friis T, Reichert JC, Hutmacher DW (2010) Расхождения между метаболической активностью и содержанием ДНК как инструмент для оценки пролиферации клеток в исследованиях рака. J Cell Mol Med 14: 1003–1013.
2. 2. Crouch SP, Kozlowski R, Slater KJ, Fletcher J (1993) Использование биолюминесценции АТФ в качестве меры пролиферации клеток и цитотоксичности.J Immunol Methods 160: 81–88.
3. 3. Mueller H, Kassack MU, Wiese M (2004) Сравнение полезности анализов МТТ, АТФ и кальцеина для прогнозирования эффективности цитотоксических агентов в различных линиях раковых клеток человека. J Biomol Screen 9: 506–515.
4. 4. Ханна Р., Бек М. (2001) Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток Celltiter-Glo ™: чувствительный и быстрый метод определения жизнеспособности клеток. Заметки Promega Cell.
5. 5. Берридж М., Херст П., Тан А. (2005) Тетразолиевые красители как инструменты в клеточной биологии: новое понимание их клеточного сокращения.ГОДОВОЙ ОБЗОР БИОТЕХНОЛОГИИ 11: 127–152.
6. 6. Денизот Ф., Ланг Р. (1986) Быстрый колориметрический анализ роста и выживания клеток. Модификации процедуры окрашивания тетразолием, повышающие чувствительность и надежность. J Immunol Methods 89: 271–277.
7. 7. Loveland BE, Johns TG, Mackay IR, Vaillant F, Wang ZX и др. (1992) Валидация анализа красителя МТТ для подсчета клеток в пролиферативных и антипролиферативных анализах. Biochem Int 27: 501–510.
8. 8. Jones LJ, Gray M, Yue ST, Haugland RP, Singer VL (2001) Чувствительное определение количества клеток с использованием анализа пролиферации клеток CyQUANT. J Immunol Methods 254: 85–98.
9. 9. Fu X, Wan S, Lyu YL, Liu LF, Qi H (2008) Этопозид индуцирует ATM-зависимый митохондриальный биогенез посредством активации AMPK. PLoS ONE 3: e2009.
10. 10. Kluza J, Marchetti P, Gallego MA, Lancel S, Fournier C и др. (2004) Митохондриальная пролиферация во время апоптоза, индуцированного противораковыми агентами: эффекты доксорубицина и митоксантрона на раковые и сердечные клетки.Онкоген 23: 7018–7030.
11. 11. Maldonado EN, Patnaik J, Mullins MR, Lemasters JJ (2010) Свободный тубулин модулирует потенциал митохондриальной мембраны в раковых клетках. Cancer Res 70: 10192–10201.
12. 12. Оропеса М., ла Мата де М., Маравер Дж. Г., Кордеро М. Д., Котан Д. и др. (2011) Апоптотическая организация и поддержание сети микротрубочек зависят от высоких клеточных уровней АТФ и заряженных митохондрий. Апоптоз 16: 404–424.
13. 13. Reipert S, Berry J, Hughes MF, Hickman JA, Allen TD (1995) Изменения митохондриальной массы в FDCP-смеси линии гемопоэтических стволовых клеток после лечения этопозидом: коррелятивное исследование с помощью многопараметрической проточной цитометрии и конфокальной и электронной микроскопии.Exp Cell Res 221: 281–288.
14. 14. Renner K, Amberger A, Konwalinka G, Kofler R, Gnaiger E (2003) Изменения митохондриального дыхания, содержания митохондрий и размера клеток после индукции апоптоза в лейкозных клетках. Biochim Biophys Acta 1642: 115–123.
15. 15. Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L (2003) Простой метод уменьшения краевого эффекта в анализах на основе клеток. J Biomol Screen 8: 566–570.
16. 16. Solit DB, Garraway LA, Pratilas CA, Sawai A, Getz G и др.(2006) Мутация BRAF предсказывает чувствительность к ингибированию MEK. Природа 439: 358–362.
17. 17. Gysin S, Lee SH, Dean NM, McMahon M (2005) Фармакологическое ингибирование передачи сигналов RAF–> MEK–> ERK вызывает остановку клеточного цикла рака поджелудочной железы посредством индуцированной экспрессии p27Kip1. Cancer Res 65: 4870–4880.
18. 18. Харрингтон Э.А., Беббингтон Д., Мур Дж., Расмуссен Р.К., Аджос-Адеогун А.О. и др. (2004) VX-680, мощный и селективный низкомолекулярный ингибитор киназ Aurora, подавляет рост опухоли in vivo.Природная медицина 10: 262–267.
19. 19. Цуй Дж.Дж., Тран-Дубе М., Шен Х., Намбу М., Кунг П.П. и др. (2011) Разработка лекарственного препарата на основе структуры кризотиниба (PF-02341066), мощного и селективного двойного ингибитора киназы мезенхимально-эпителиального переходного фактора (c-MET) и киназы анапластической лимфомы (ALK). J Med Chem 54: 6342–6363.
20. 20. Стигмайер М., Хоффманн М., Баум А., Ленарт П., Петронски М. и др. (2007) BI 2536, мощный и селективный ингибитор поло-подобной киназы 1, подавляет рост опухоли in vivo.Curr Biol 17: 316–322.
21. 21. Lénárt P, Petronczki M, Steegmaier M, Di Fiore B, Lipp JJ, et al. (2007) Низкомолекулярный ингибитор BI 2536 раскрывает новое понимание митотической роли поло-подобной киназы 1. Curr Biol 17: 304–315.
22. 22. Сазерленд Дж. Дж., Лоу Дж., Блоссер В., Доулесс М., Энглер Т. А. и др. (2011) Надежный подход к визуализации с высоким содержанием для исследования механизма действия и фенотипических результатов модуляторов клеточного цикла. Mol Cancer Ther 10: 242–254.
23. 23. Munshi N, Jeay S, Li Y, Chen CR, France DS, et al. (2010) ARQ 197, новый и селективный ингибитор тирозинкиназы рецептора c-Met человека с противоопухолевой активностью. Mol Cancer Ther 9: 1544–1553.
24. 24. Basilico C, Pennacchietti S, Vigna E, Chiriaco C, Arena S, et al .. (2013) Тивантиниб (ARQ197) проявляет цитотоксическую активность, которая не зависит от его способности связывать MET. Clin Cancer Res. DOI: https: //doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-12-3459.
25. 25.Cottet-Rousselle C, Ronot X, Leverve X, Mayol JF (2011) Цитометрическая оценка митохондрий с использованием флуоресцентных зондов. Цитометрия А 79: 405–425.
26. 26. Джонсон I, редактор (2011) Зонды для митохондрий — раздел 12.2. Справочник по молекулярным зондам — ​​Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки.
27. 27. Posakony JW, England JM, Attardi G (1977) Рост и деление митохондрий во время клеточного цикла в клетках HeLa. J Cell Biol 74: 468–491.
28. 28. Лайман С.К., Кроули С.К., Гонг Р., Адамкевич Дж. И., МакГрат Г. и др. (2011) Высокопроизводительный и высокопроизводительный анализ нарушений клеточного цикла, вызванных ингибитором HSP90 XL888. PLoS ONE 6: e17692.
29. 29. Нойман Б., Вальтер Т., Эрике Дж. К., Балкешер Дж., Эрфле Х. и др. (2010) Фенотипическое профилирование генома человека с помощью покадровой микроскопии выявляет гены деления клеток. Природа 464: 721–727.
30. 30. Feng Y, Mitchison TJ, Bender A, Young DW, Tallarico JA (2009) Многопараметрическое фенотипическое профилирование: использование клеточных эффектов для характеристики низкомолекулярных соединений.Nat Rev Drug Discov 8: 567–578.
31. 31. Loo LH, Lin HJ, Steininger RJ, Wang Y, Wu LF и др. (2009) Подход для расширяемого профилирования молекулярных состояний клеточных субпопуляций. Нат методы 6: 759–765.
32. 32. Перлман З.Э., Slack MD, Фенг Й., Митчисон Т.Дж., Ву Л.Ф. и др. (2004) Многомерное профилирование лекарств с помощью автоматизированной микроскопии. Наука 306: 1194–1198.
33. 33. Newman RH, Zhang J (2008) Fucci: уличные фонари на пути к митозу.Chem Biol 15: 97–98.
34. 34. Gasparri F, Ciavolella A, Galvani A (2007) Профилирование ингибиторов клеточного цикла с помощью анализа высокого содержания. Успехи экспериментальной медицины и биологии, Vol. 604: 137–148.
35. 35. Хэн BC, Das GK, Zhao X, Ma LL, Tan TTY и др. (2010) Сравнительная оценка цитотоксичности наноматериалов лантаноидов на линиях клеток мыши и человека с помощью метаболических анализов и количественного определения ДНК. Биоинтерфазы 5: FA88 – FA97.
36. 36. Ван П., Хеннинг С.М., Хебер Д. (2010) Ограничения анализов на основе МТТ и MTS для измерения антипролиферативной активности полифенолов зеленого чая.PLoS ONE 5: e10202.
37. 37. Сакауэ-Савано А., Кобаяши Т., Отава К., Мияваки А. (2011) Модуляция клеточного цикла, вызванная лекарствами, приводящая к остановке клеточного цикла, неправильной сегрегации ядер или эндорепликации. BMC Cell Biol 12: 2.
38. 38. Montecucco A, Biamonti G (2007) Клеточный ответ на лечение этопозидом. Cancer Lett 252: 9–18.
39. 39. Sims JT, Plattner R (2009) MTT-анализы нельзя использовать для изучения эффектов STI571 / Gleevec на жизнеспособность линий солидных опухолевых клеток.Cancer Chemother Pharmacol 64: 629–633.
40. 40. Pagliacci MC, Spinozzi F, Migliorati G, Fumi G, Smacchia M и др. (1993) Генистеин подавляет рост опухолевых клеток in vitro, но усиливает митохондриальное восстановление солей тетразолия: еще одна ловушка при использовании анализа МТТ для оценки роста и выживаемости клеток. Eur J Cancer 29A: 1573–1577.
41. 41. Макгоуэн Э.М., Аллинг Н., Джексон Э.А., Ягуб Д., Хаасс Н.К. и др. (2011) Оценка остановки клеточного цикла в эстроген-чувствительных клетках рака молочной железы MCF-7: подводные камни анализа MTS.PLoS ONE 6: e20623.
42. 42. Рудольф К., Червинка М., Рудольф Э. (2009) Цитотоксичность и митохондриальный апоптоз, индуцированный этопозидом в клетках меланомы. Рак Инвест 27: 704–717.
43. 43. Китами Т., Логан Д. Дж., Негри Дж., Хасака Т., Толлидей Нью-Джерси и др. (2012) Химический скрининг, исследующий взаимосвязь между содержанием митохондрий и размером клеток. PLoS ONE 7: e33755.
44. 44. Вагнер Б.К., Китами Т., Гилберт Т.Дж., Пек Д., Раманатан А. и др. (2008) Крупномасштабное химическое вскрытие функции митохондрий.Nat Biotechnol 26: 343–351.
45. 45. Brand MD, Nicholls DG (2011) Оценка митохондриальной дисфункции в клетках. Biochem J 435: 297–312.
46. 46. Кушнарева Ю., Ньюмейер Д. Д. (2010) Биоэнергетика и гибель клеток. Ann N Y Acad Sci 1201: 50–57.
47. 47. Бучакчян М.Р., Корнблут С. (2010) Двигатель, управляющий кораблем: метаболическое управление пролиферацией и смертью клеток. Nat Rev Mol Cell Biol 11: 715–727.

Анализы цитотоксичности и жизнеспособности клеток in vitro: принципы, преимущества и недостатки люминесцентный и др.).

2.1. Анализы исключения красителей

Долю жизнеспособных клеток в клеточной популяции можно оценить различными методами. Самый простой и широко используемый метод — метод исключения красителей. В методе исключения красителей жизнеспособные клетки исключают красители, но мертвые клетки не исключают их. Хотя процедура окрашивания довольно проста, экспериментальная процедура с большим количеством образцов трудна и требует много времени [4]. Определение целостности мембраны возможно с помощью метода исключения красителей.Было использовано множество таких красителей, включая эозин, конго красный, эритрозин B и трипановый синий [5, 6]. Из перечисленных красителей наиболее широко используется трипановый синий [7, 8, 9, 10].

Если используются анализы исключения красителей, необходимо учитывать следующие факторы: (i) смертельно поврежденные цитотоксическими агентами клетки могут потребовать несколько дней для потери целостности их мембран, (ii) выжившие клетки могут продолжать пролиферировать в течение этого времени и (iii) ) некоторые смертельно поврежденные клетки, по-видимому, не окрашиваются красителем в конце периода культивирования, потому что они могут подвергнуться раннему распаду.Факторы (ii) и (iii) могут вызвать недооценку гибели клеток, если результаты анализа основаны на процентном выражении жизнеспособности [11, 12, 13].

Анализы исключения красителей имеют уникальные преимущества для тестирования химиочувствительности. Они сравнительно просты, требуют небольшого количества клеток, работают быстро и способны обнаруживать гибель клеток в неделящихся популяциях клеток. Необходимы дальнейшие исследования возможной роли этих тестов в тестировании на химиочувствительность [11]. Однако ни один из этих красителей не рекомендуется для использования на однослойных культурах клеток, а скорее они предназначены для клеток в суспензии; таким образом, монослойные клетки необходимо сначала обработать трипсином [6].

2.1.1. Анализ исключения красителя трипановым синим

Этот анализ исключения красителя используется для определения количества жизнеспособных и / или мертвых клеток в клеточной суспензии. Трипановый синий — это большая отрицательно заряженная молекула. Анализ исключения красителя трипановым синим основан на том принципе, что живые клетки обладают неповрежденными клеточными мембранами, которые исключают этот краситель, а мертвые клетки — нет. В этом анализе прикрепленные или неприлипающие клетки инкубируют с серийными разведениями тестируемых соединений в течение различных периодов времени. После обработки соединением клетки промывают и суспендируют.Суспензию клеток смешивают с красителем, а затем визуально исследуют, чтобы определить, поглощают ли клетки краситель или нет. Жизнеспособные клетки будут иметь чистую цитоплазму, тогда как мертвые клетки будут иметь синюю цитоплазму [14, 15]. Количество жизнеспособных и / или мертвых клеток в единице объема определяют с помощью световой микроскопии в процентах от необработанных контрольных клеток [15, 16].

Преимущества: Этот метод прост, недорог и является хорошим индикатором целостности мембраны [17], а мертвые клетки окрашиваются в синий цвет в течение нескольких секунд после воздействия красителя [18].

Недостатки: Подсчет клеток обычно проводится с помощью гемацитометра [19]. Следовательно, могли возникнуть ошибки подсчета (~ 10%). Ошибки подсчета объясняются плохим диспергированием клеток, потерей клеток во время диспергирования клеток, неточным разбавлением клеток, неправильным заполнением камеры и наличием пузырьков воздуха в камере [17].

Хотя процедура окрашивания довольно проста, трудно обрабатывать большое количество образцов одновременно, особенно там, где требуется точное время прогрессирования цитотоксических эффектов [4].Кроме того, окрашивание трипановым синим нельзя использовать для различения здоровых клеток и клеток, которые живы, но теряют функции клеток. Следовательно, он недостаточно чувствителен для использования для тестирования цитотоксичности in vitro. Еще один недостаток трипанового синего — побочное токсическое действие этого красителя на клетки млекопитающих [20].

2.1.2. Анализ исключения красителя эритрозина B

Эритрозин B, также известный как эритрозин или красный № 3, в основном используется в качестве пищевого красителя [20, 21]. Эритрозин B уже был введен как жизненно важный краситель для подсчета жизнеспособных клеток.Принцип этого анализа исключения красителя аналогичен принципу анализа исключения красителя трипанового синего. Хотя эритрозин B является альтернативным биологически безопасным витальным красителем для подсчета клеток; он не широко используется для подсчета жизнеспособных или мертвых клеток.

Преимущества: Обладает такими преимуществами, как низкая стоимость, универсальность и биобезопасность [20].

Недостатки: Процедура трудоемкая и трудоемкая. Кроме того, к потенциальным недостаткам можно отнести загрязнение многоразовой камеры для подсчета клеток, вариации скорости заполнения гемоцитометра и межпользовательские вариации [20].

2.2. Колориметрические анализы

Принцип колориметрических анализов — это измерение биохимического маркера для оценки метаболической активности клеток. Реагенты, используемые в колориметрических анализах, приобретают окраску в зависимости от жизнеспособности клеток, что позволяет колориметрическим способом измерить жизнеспособность клеток с помощью спектрофотометра. Колориметрические анализы применимы для прикрепленных или суспендированных клеточных линий, просты в выполнении и сравнительно экономичны [22, 23]. Коммерческие наборы колориметрических анализов доступны от нескольких компаний, и обычно экспериментальные процедуры этих анализов доступны в упаковках наборов.

2.2.1. МТТ-анализ

МТТ-анализ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2–5-дифенилтетразолийбромид) — один из наиболее часто используемых колориметрических тестов для оценки цитотоксичности или жизнеспособности клеток [24]. Этот анализ определяет в основном жизнеспособность клеток посредством определения митохондриальной функции клеток путем измерения активности митохондриальных ферментов, таких как сукцинатдегидрогеназа [18]. В этом анализе НАДН восстанавливает МТТ до пурпурного формазана. Этот продукт может быть определен количественно по поглощению света на определенной длине волны.

Преимущества: Этот метод намного превосходит ранее упомянутые методы исключения красителей, потому что он прост в использовании, безопасен, имеет высокую воспроизводимость и широко используется для определения жизнеспособности клеток и тестов на цитотоксичность [18, 25].

Недостатки: Формазан МТТ нерастворим в воде и образует в клетках пурпурные игольчатые кристаллы. Следовательно, перед измерением оптической плотности требуется органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (ДМСО) или изопропанол, для солюбилизации кристаллов.Кроме того, цитотоксичность формазана МТТ затрудняет удаление среды для культивирования клеток из лунок планшета из-за плавающих клеток с иглами формазана МТТ, что дает значительную ошибку между лунками [18, 26].

Необходимо провести дополнительные контрольные эксперименты для уменьшения ложноположительных или ложноотрицательных результатов, вызванных фоновыми помехами из-за включения частиц. Это вмешательство могло привести к переоценке жизнеспособности соты. Это часто можно контролировать, вычитая фоновое поглощение клеток в присутствии частиц, но без реагентов для анализа [18, 26].

2.2.2. Анализ MTS

Анализ MTS (5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4,5-диметил-тиазоли) -3- (4-сульфофенил) тетразолий, анализ внутренней соли) представляет собой колориметрический анализ. Этот анализ основан на превращении соли тетразолия в окрашенный формазан под действием митохондриальной активности живых клеток. Количество продуцируемого формазана зависит от количества жизнеспособных клеток в культуре и может быть измерено спектрофотометром при 492 нм.

Преимущества: Предыдущие исследования показывают, что анализ цитотоксичности MTS in vitro сочетает в себе все особенности хорошей системы измерения с точки зрения простоты использования, точности и быстрого определения токсичности [27, 28].Анализ MTS — это быстрый, чувствительный, экономичный и специфический анализ цитотоксичности in vitro. Производительность этого анализа очень конкурентоспособна по сравнению с другими токсикологическими тестами. Этот анализ обеспечивает идеальные свойства для измерения цитотоксичности, поскольку он прост в использовании, быстр, надежен и недорого. Следовательно, его можно использовать для токсикологической оценки на месте [27, 29, 30, 31].

Недостатки: Уровень поглощения, измеренный при 492 нм, зависит от времени инкубации, типа и количества клеток.Отношение реагентов для обнаружения MTS к клеткам в культуре также влияет на измеренный уровень поглощения. Предыдущие исследования предполагали линейную зависимость между временем инкубации и абсорбцией при коротком времени инкубации до 5 часов [29, 32, 33]. Поэтому подходящее время инкубации для этого анализа составляет 1–3 часа.

2.2.3. Анализ XTT

Колориметрический метод, основанный на тетразолиевой соли XTT (2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -5-карбоксанилид-2H-тетразолий, мононатриевая соль) был впервые описан Scudiero et al. al.[34]. В то время как МТТ производит нерастворимое в воде соединение формазана, которое требует растворения красителя для измерения его поглощения, ХТТ производит водорастворимый краситель. Процедура XTT предназначена просто для измерения пролиферации и поэтому является отличным решением для количественной оценки клеток и определения их жизнеспособности. XTT используется для анализа пролиферации клеток в ответ на различные факторы роста. Он также используется для определения цитотоксичности.

Этот анализ основан на восстановлении способности соли тетразолия XTT до соединений формазана оранжевого цвета под действием метаболически активных клеток.Формазан оранжевого цвета растворим в воде, и его интенсивность можно измерить с помощью спектрофотометра. Существует линейная зависимость между интенсивностью формазана и количеством жизнеспособных клеток. Использование многолуночных планшетов и спектрофотометра (или ридера ELISA) позволяет проводить исследования с большим количеством образцов и легко и быстро получать результаты. Процедура этого анализа включает культивирование клеток в 96-луночном планшете, добавление реагента XTT и инкубацию в течение 2–24 часов. Во время инкубации образуется оранжевый цвет, и его интенсивность можно измерить с помощью спектрофотометра [34, 35].

Преимущества: Анализ XTT — это быстрый, чувствительный, простой в использовании и безопасный метод. Обладает высокой чувствительностью и точностью [35].

Недостатки: Эффективность анализа XTT зависит от восстановительной способности жизнеспособных клеток с активностью митохондриальной дегидрогеназы. Следовательно, изменения восстановительной способности жизнеспособных клеток в результате ферментативной регуляции, pH, концентрации клеточных ионов (например, натрия, кальция, калия), изменения клеточного цикла или других факторов окружающей среды могут повлиять на окончательные показания абсорбции [34, 35].

2.2.4. Анализ WST-1

Анализ пролиферации клеток WST-1 (2- (4-иодофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфофенил) -2 H мононатриевой соли тетразолия) , колориметрический анализ, предназначенный для измерения относительной скорости пролиферации клеток в культуре. Принцип этого анализа основан на превращении соли тетразолия WST-1 в хорошо растворимый в воде формазан ферментами митохондриальной дегидрогеназы в присутствии промежуточного акцептора электронов, такого как mPMS (1-метокси-5-метилфеназиния метил сульфат) [36].Водорастворимая соль высвобождается в среду для культивирования клеток. В течение инкубационного периода реакция вызывает изменение цвета, которое прямо пропорционально количеству митохондриальной дегидрогеназы в культуре клеток, и, таким образом, анализ измеряет метаболическую активность клеток.

Для проведения анализа готовый к использованию реагент WST-1 добавляется непосредственно в среду клеток, культивируемых в многолуночных планшетах. Затем культурам дают от 30 минут до 4 часов, чтобы преобразовать реагент в форму красителя.Затем планшет сразу же считывают при 450 нм с эталонным считыванием при 630 нм [37].

Преимущества: Он прост в использовании, безопасен, имеет высокую воспроизводимость и широко используется для определения жизнеспособности клеток и тестов на цитотоксичность. Кроме того, индикаторы фенолового красного в среде для культивирования клеток не влияют на реакцию красителя. Поскольку окрашенный краситель, полученный в конце эксперимента, растворим в воде, не требуется растворитель и дополнительное время инкубации [37].

Недостатки: Стандартное время инкубации WST-1 составляет 2 часа.Пока неясно, может ли однократное добавление WST-1 отражать влияние тестирующих агентов в разные моменты времени на тенденцию относительной жизнеспособности клеток [37].

2.2.5. Анализ WST-8

Анализ WST-8 представляет собой колориметрический анализ для определения количества жизнеспособных клеток и может использоваться для анализов пролиферации клеток, а также анализов цитотоксичности. WST-8 (2- (2-метокси-4-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфофенил) -2 H тетразолий, мононатриевая соль), высокостабильный и водно- растворимый WST используется в наборе для подсчета клеток-8 (CCK-8).Он более чувствителен, чем WST-1, особенно при нейтральном pH [37]. Благодаря электронному посреднику 1-метокси ПМС в этом наборе очень стабилен, а CCK-8 стабилен не менее 6 месяцев при комнатной температуре и 1 год при 0–5 ^o C. Начиная с WST-8, Формазан WST-8 и 1-метокси PMS не обладают цитотоксичностью по отношению к клеткам в культуральной среде, те же клетки из предыдущего анализа можно использовать для дополнительных экспериментов.

Преимущества: WST-8 не проницаем для клеток, что приводит к низкой цитотоксичности.Следовательно, после анализа можно продолжить дальнейшие эксперименты с теми же клетками. Кроме того, он производит водорастворимый формазан при восстановлении клеток, что обеспечит дополнительное преимущество метода, позволяя упростить процедуру анализа и не требуя дополнительной стадии для растворения формазана [28].

Недостатки: Важным моментом является то, что на уменьшение количества субстратов для анализа влияют изменения внутриклеточной метаболической активности, которая не оказывает прямого влияния на общую жизнеспособность клеток [15].

2.2.6. Анализ цитотоксичности ЛДГ (лактатдегидрогеназы)

Анализ цитотоксичности ЛДГ (лактатдегидрогеназы) — это колориметрический метод определения клеточной цитотоксичности. Набор для анализа цитотоксичности ЛДГ может использоваться с различными типами клеток не только для анализа цитотоксичности, опосредованной клетками, но также для оценки цитотоксичности, опосредованной токсичными химическими веществами и другими тестируемыми соединениями. В этом анализе количественно измеряется стабильный цитозольный фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Этот фермент высвобождается из поврежденных клеток.ЛДГ — это фермент, который обычно находится в цитоплазме клетки. Когда жизнеспособность клеток снижается, повышается проницаемость плазматической мембраны, и поэтому фермент ЛДГ высвобождается в среду для культивирования клеток. Высвобожденный ЛДГ измеряется сопряженной ферментативной реакцией, которая приводит к превращению соли тетразолия (йодонитротетразолия (INT)) в формазан красного цвета под действием диафоразы. На первом этапе ЛДГ катализирует превращение лактата в пируват, и таким образом НАД восстанавливается до НАДН / Н ⁺ .На втором этапе катализатор (диафораза) переводит H / H ⁺ из NADH / H ⁺ в тетразолиевую соль 2- (4-иодфенил) -3- (4-нитрофенил) -5-фенилтетразолий хлорид (INT). , который восстанавливается до красного формазана [38, 39].

Активность LDH определяется как окисление NADH или восстановление INT за определенный период времени. Образовавшийся красный формазан максимально поглощает при 492 нм и может быть количественно измерен при 490 нм.

Детергент Triton X-100 обычно используется в качестве положительного контроля в анализе ЛДГ для определения максимального высвобождения ЛДГ из клеток.Кроме того, хорошо известные мембранолитические частицы, такие как кристаллический диоксид кремния, можно использовать в качестве положительного контроля в анализе ЛДГ [40].

Преимущества: Надежность, скорость и простота оценки — вот некоторые характеристики этого анализа. Потому что потеря внутриклеточной ЛДГ и ее выброс в культуральную среду является индикатором необратимой гибели клеток из-за повреждения клеточной мембраны [38, 41].

Недостатки: Основным ограничением этого анализа является то, что сыворотка и некоторые другие соединения обладают неотъемлемой активностью ЛДГ.Например, фетальная сыворотка теленка имеет чрезвычайно высокие фоновые значения. Таким образом, этот анализ ограничен условиями отсутствия сыворотки или низкого уровня сыворотки, ограничивая период культивирования для анализа (в зависимости от толерантности ваших клеток к низкой сыворотке) и сокращая объем анализа, поскольку он больше не может позволить определить вызванную гибелью клеток гибель клеток. при нормальных условиях роста (т.е. в 10% -ной эмбриональной сыворотке теленка). Как минимум, вы всегда должны сначала тестировать анализ с неиспользованной аликвотой среды, которую вы собираетесь использовать, и сравнивать показания со средой без добавок (например,грамм. прямая DMEM) [42].

2.2.7. SRB (Sulforhodamine B) assay

SRB (Sulforhodamine B) assay — это быстрый и чувствительный колориметрический метод измерения цитотоксичности, вызванной лекарством, как в прикрепленных, так и в суспензионных культурах клеток. Этот анализ, впервые описанный Скеханом и его коллегами, был разработан для использования в ориентированной на болезнь крупномасштабной программе открытия противоопухолевых лекарств Национального института рака (NCI), которая была запущена в 1985 году. SRB — ярко-розовый краситель на основе амиоксантена с двумя сульфонами. группы.В умеренно кислых условиях SRB связывается с основными аминокислотными остатками белка в клетках, фиксированных ТСА (трихлоруксусная кислота), чтобы обеспечить чувствительный индекс клеточного белка. Анализ SRB также используется для оценки образования и исчезновения колоний [43].

Преимущества: Анализ SRB прост, быстр и чувствителен. Он обеспечивает хорошую линейность с числом клеток, позволяет использовать концентрации насыщающего красителя, менее чувствителен к колебаниям окружающей среды, не зависит от промежуточного метаболизма и обеспечивает фиксированную конечную точку, которая не требует чувствительного ко времени измерения начальной скорости реакции [43 ].Воспроизводимость этого анализа высокая.

Недостатки: Важно получить и поддерживать гомогенную суспензию клеток. Следует избегать клеточных скоплений / агрегатов для высокой эффективности анализа.

2.2.8. Анализ поглощения нейтрального красного (NRU)

Анализ поглощения нейтрального красного (NRU) также является одним из наиболее часто используемых колориметрических тестов на цитотоксичность / жизнеспособность клеток. Этот тест был разработан Боренфройндом и Пуэрнером [44]. Этот анализ был основан на способности жизнеспособных клеток поглощать суправитальный краситель нейтральный красный.Этот слабо катионный краситель проникает через клеточные мембраны путем неионной пассивной диффузии и концентрируется в лизосомах. Затем краситель экстрагируют из жизнеспособных клеток, используя подкисленный раствор этанола, и оптическую плотность красителя измеряют с помощью спектрофотометра.

Поглощение нейтрального красного зависит от способности клеток поддерживать градиенты pH за счет производства АТФ. При физиологическом pH чистый заряд красителя равен нулю. Этот заряд позволяет красителю проникать через клеточные мембраны. Внутри лизосом существует протонный градиент для поддержания pH ниже, чем в цитоплазме.Таким образом, краситель становится заряженным и удерживается внутри лизосом. Когда клетка умирает или градиент pH снижается, краситель не может удерживаться. Кроме того, поглощение нейтрального красного жизнеспособными клетками может быть изменено путем изменения клеточной поверхности или лизосомных мембран. Таким образом, можно различать жизнеспособные, поврежденные и мертвые клетки [44]. Поглощение нейтрального красного красителя лизосомами является высокочувствительным индикатором жизнеспособности клеток. Анализ может количественно определять жизнеспособность клеток и измерять репликацию клеток, цитостатические эффекты или цитотоксические эффекты в зависимости от плотности посева [45].Поглощение измеряют при 540 нм на спектрофотометре для считывания многолуночных планшетов.

Преимущества: анализ NRR является хорошим маркером повреждения лизосом. Кроме того, преимуществами этого анализа являются скорость и простота оценки.

Недостатки: Сообщалось, что на анализ NRR либо минимально, либо совсем не влияют природные факторы, такие как температура и соленость, но в основном на него влияют загрязнители [46].

2.2.9. Анализ CVS (анализ кристаллического фиолетового)

Прилипшие клетки отделяются от планшетов с культурой клеток во время гибели клеток.Эта функция может использоваться для косвенной оценки гибели клеток и для определения различий в скорости пролиферации при стимуляции цитотоксическими агентами. Одним из простых методов определения сохраняющейся адгезии клеток является анализ кристаллического фиолетового. В этом анализе краситель кристаллического фиолетового связывается с белками и ДНК жизнеспособных клеток, и, таким образом, прикрепленные клетки окрашиваются этим красителем. Клетки теряют свою адгезию во время гибели клеток и впоследствии теряются из популяции клеток, что снижает количество окрашивания кристаллическим фиолетовым в культуре.Анализ кристаллического фиолетового — это быстрый и надежный метод скрининга, который подходит для изучения воздействия химиотерапевтических средств или других соединений на выживаемость клеток и ингибирование роста [47].

Преимущества: Окрашивание кристаллическим фиолетовым — это быстрый и универсальный тест для скрининга жизнеспособности клеток в различных условиях стимуляции [48]. Однако это потенциально скомпрометировано пролиферативными ответами, которые происходят одновременно с ответами на гибель клеток. Следовательно, в анализ могут быть включены химические ингибиторы каспаз и / или некроптоза [49, 50].Альтернативно, молекулярные исследования (например, сверхэкспрессия или нокдаун) могут быть выполнены для более точного изучения природы гибели клеток [51].

Недостатки: Анализ кристаллического фиолетового нечувствителен к изменениям метаболической активности клеток. Следовательно, этот анализ не подходит для исследований соединений, влияющих на клеточный метаболизм. Хотя анализ кристаллического фиолетового подходит для изучения влияния химиотерапевтических средств или других соединений на выживаемость клеток и ингибирование роста, он не позволяет измерить скорость пролиферации клеток [51].

2.3. Флуорометрические анализы

Флуорометрические анализы жизнеспособности клеток и цитотоксичности легко выполнять с использованием флуоресцентного микроскопа, флуорометра, флуоресцентного микропланшетного ридера или проточного цитометра, и они предлагают много преимуществ по сравнению с традиционными методами исключения красителей и колориметрическими анализами. Флуорометрические анализы также применимы для прикрепленных или суспендированных клеточных линий и просты в использовании. Эти анализы более чувствительны, чем колориметрические [52, 53, 54]. Коммерческие наборы флуорометрических анализов доступны от нескольких компаний, и обычно экспериментальные процедуры этих анализов доступны в упаковках наборов.

2.3.1. Анализ alamarBlue (AB)

Анализ alamarBlue также известен как анализ восстановления резазурина. Анализ alamarBlue основан на превращении голубого нефлуоресцентного красителя резазурина, который превращается в розовый флуоресцентный резоруфин митохондриальными и другими ферментами, такими как диафораза [53].

Резазурин представляет собой феноксазин-3-он краситель и проницаемый для клеток окислительно-восстановительный индикатор, который можно использовать для мониторинга количества жизнеспособных клеток с помощью протоколов, аналогичных тем, которые используют соединения тетразолия [55].Известно, что он действует как промежуточный акцептор электронов в цепи переноса электронов между окончательным восстановлением кислорода и цитохромоксидазой, заменяя молекулярный кислород в качестве акцептора электронов [52]. Это нетоксичное и проницаемое для клеток соединение. Цвет этого соединения синий, он не флуоресцирует. Попадая в клетки, резазурин восстанавливается до резоруфина. Резоруфин имеет красный цвет и обладает высокой флуоресценцией. Жизнеспособные клетки непрерывно превращают резазурин в резофурин, увеличивая общую флуоресценцию и цвет среды для культивирования клеток.Количество продуцируемого резофурина связано с количеством жизнеспособных клеток. Отношение жизнеспособных клеток может быть определено количественно с использованием флуориметра-ридера для микропланшетов, снабженного набором фильтров для возбуждения 560 нм / эмиссии 590 нм. Резофурин также можно измерить по изменению оптической плотности, но определение оптической плотности используется нечасто, поскольку определение оптической плотности менее чувствительно, чем измерение флуоресценции.

Инкубационный период, необходимый для генерации достаточного флуоресцентного сигнала выше фона, обычно составляет около 1–4 часов, в зависимости от метаболической активности клеток, плотности клеток на лунку и других условий, таких как тип культуральной среды [54].

Преимущества: Анализ alamarBlue (восстановление резазурина) относительно недорог и более чувствителен, чем анализы на тетразолий. Кроме того, его можно объединить с другими методами, такими как измерение активности каспазы, чтобы собрать больше информации о механизме цитотоксичности.

Недостатки: Возможны флуоресцентные помехи от тестируемых соединений и часто игнорируемые прямые токсические эффекты на клетки [54].

2.3.2. Анализ CFDA-AM

CFDA-AM (5-карбоксифлуоресцеиндиацетат, ацетоксиметиловый эфир) — еще один флуорогенный краситель, который используется для определения цитотоксичности.Это индикатор целостности плазматической мембраны. Краситель CFDA-AM представляет собой нетоксичный субстрат эстеразы, который может превращаться неспецифическими эстеразами жизнеспособных клеток из проницаемого через мембрану неполярного нефлуоресцентного вещества в полярный флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (CF). Превращение CFDA-AM в CF клетками указывает на целостность плазматической мембраны, поскольку только неповрежденная мембрана может поддерживать цитоплазматическую среду, которая необходима для поддержания активности эстеразы [56].

Преимущества: Было показано, что анализы CFDA-AM и alamarBlue применимы параллельно к одному и тому же набору клеток, поскольку оба нетоксичны для клеток, требуют одинакового времени инкубации и могут быть обнаружены на разных длинах волн без помех [56 , 57, 58].

Недостатки: Возможны флуоресцентные помехи от тестируемых соединений.

2.3.3. Анализ маркера жизнеспособности протеазы (анализ GF-AFC)

Измерение консервативной и конститутивной ферментативной активности протеаз в жизнеспособных клетках используется как хороший индикатор жизнеспособности клеток. Проницаемый для клеток субстрат флуорогенной протеазы (глицилфенилаланиламинофторокумарин; GF-AFC) был недавно разработан для селективного обнаружения протеазной активности, которая ограничена жизнеспособными клетками [59].Субстрат GF-AFC может проникать в жизнеспособные клетки. В этих клетках активность цитоплазматической аминопептидазы удаляет аминокислоты gly и phe с высвобождением аминофторокумарина (AFC) и выработкой флуоресцентного сигнала, пропорционального количеству жизнеспособных клеток [54].

Когда клетки умирают, эта протеазная активность быстро теряется. Следовательно, эта протеазная активность является селективным маркером жизнеспособной клеточной популяции. Было показано, что сигнал, генерируемый этим подходом к анализу, хорошо коррелирует с другими известными методами определения жизнеспособности клеток, такими как анализ АТФ [54].

Преимущества: Относительно нетоксичен для клеток в культуре. Кроме того, в отличие от воздействия на клетки тетразолия, длительное воздействие субстратных клеток GF-AFC приводит к небольшому изменению жизнеспособности клеток. Этот анализ подходит для мультиплексирования с другими анализами, поскольку в конце анализа популяция клеток остается жизнеспособной и может использоваться для последующих анализов. Кроме того, время инкубации намного короче (30 мин-1 час) по сравнению с 1–4 часами, необходимыми для анализа тетразолия [54].

Недостатки: Возможны флуоресцентные помехи от тестируемых соединений.

2.4. Люминометрические анализы

Люминометрические анализы обеспечивают быстрое и простое определение клеточной пролиферации и цитотоксичности в клетках млекопитающих. Эти анализы могут быть выполнены в удобном формате 96-луночного и 384-луночного микропланшета и детектированы с помощью люминометрического ридера микропланшетов [54, 60, 61]. Замечательной особенностью люминометрических анализов является постоянный и стабильный сигнал свечения, возникающий после добавления реагента.Этот атрибут можно использовать для получения значений жизнеспособности и цитотоксичности из одной лунки [59]. Коммерческие наборы люминометрических анализов доступны от нескольких компаний, и обычно экспериментальные процедуры этих анализов доступны в пакетах наборов.

2.4.1. Анализ АТФ

АТФ (аденозинтрифосфат) представляет собой наиболее важный резервуар химической энергии в клетках и используется для процессов биологического синтеза, передачи сигналов, транспорта и движения. Следовательно, клеточный АТФ — одна из наиболее чувствительных конечных точек при измерении жизнеспособности клеток [62].Когда клетки повреждаются летально и теряют целостность мембран, они теряют способность синтезировать АТФ, и уровень АТФ в клетках резко снижается [54, 63]. Анализ АТФ основан на реакции люциферина на оксилюциферин. Фермент люцифераза катализирует эту реакцию в присутствии ионов Mg ²⁺ и АТФ, давая люминесцентный сигнал. Существует линейная зависимость между интенсивностью люминесцентного сигнала и концентрацией АТФ [61] или количеством клеток [64].

Химический анализ АТФ обычно позволяет обнаруживать менее 10 клеток на лунку, поэтому широко используется формат 1536-луночного планшета.

Преимущества: Анализ АТФ — это самый быстрый в использовании анализ жизнеспособности клеток, наиболее чувствительный и менее подверженный артефактам, чем другие анализы жизнеспособности. Люминесцентный сигнал достигает устойчивого состояния и стабилизируется в течение 10 минут после добавления реагента. Он не имеет стадии инкубации для преобразования субстрата в окрашенное соединение. Это также исключает необходимость обращения с пластиной [54].

Недостатки: Чувствительность анализа АТФ обычно ограничивается воспроизводимостью пипетирования повторных образцов, а не результатом химического анализа [54].

2.4.2. Анализ жизнеспособности в реальном времени

Недавно был разработан новый подход для измерения количества жизнеспособных клеток в реальном времени [60]. В этом анализе используется сконструированная люцифераза, полученная из морских креветок, и маломолекулярный просубстрат. Просубстрат и люцифераза добавляются непосредственно в среду для культивирования клеток в качестве реагента. Просубстрат не является субстратом люциферазы. Жизнеспособные клетки с активным метаболизмом восстанавливают просубстрат до субстрата, который используется люциферазой для генерации люминесцентного сигнала.Анализ можно проводить в двух форматах: непрерывное считывание и измерение конечной точки. В формате непрерывного считывания люминесцентный сигнал может многократно записываться из лунок для образцов в течение длительного периода для измерения количества клеток в «реальном времени» [54, 60].

Преимущества: Этот анализ — единственный анализ, который позволяет в реальном времени измерять жизнеспособность / цитотоксичность клеток. Быстрое снижение люминесцентного сигнала после гибели клеток позволяет объединить этот анализ с другими люминесцентными анализами, которые содержат стадию лизиса, которая убивает клетки.Уменьшение люминесценции после гибели клеток важно для устранения помех для последующих люминесцентных анализов [54, 60].

Недостатки: Ограничение анализа в реальном времени происходит из-за возможного истощения просубстрата метаболически активными клетками. Обычно генерируемый люминесцентный сигнал коррелирует с количеством метаболически активных клеток. Однако продолжительность времени, в течение которого люминесцентный сигнал будет линейным с количеством клеток, будет зависеть от количества клеток на лунку и их метаболической активности.Поэтому рекомендуется эмпирически определять максимальное время инкубации для поддержания линейности для каждого типа клеток и плотности посева [54, 60].

МТС отказывается от ноябрьских избирательных мер по расширению транзита, ссылаясь на пандемию коронавируса

Амбициозная кампания по расширению автобусных и троллейбусных перевозок с повышением налогов в ноябрьском голосовании была официально расформирована в четверг, поскольку лидеры сосредоточили внимание на сохранении транзитных услуг в условиях коронавируса пандемия.

Кампания городской транспортной системы Сан-Диего, получившая название ElevateSD, предусматривала такие проекты, как строительство трамвайного сообщения с аэропортом и наземного трамвая между Юниверсити-Сити и Сорренто-Вэлли.

«С тяжелым сердцем мы сталкиваемся с очевидной и неизбежной судьбой Elevate в избирательном цикле 2020 года», — сказал окружной инспектор Натан Флетчер во время заседания совета директоров МТС, которое он возглавляет, в четверг.

«Прискорбная реальность глобальной пандемии, с которой мы сталкиваемся прямо сейчас, заключается в том, что … в обозримом будущем мы как агентство действительно сосредоточимся на том, как мы реагируем на стоящие перед нами проблемы общественного здравоохранения, как мы можем гарантировать, что предоставляется услуга транзита? » добавил он.

Президент городского совета Сан-Диего Джорджетта Гомес, которая участвовала в реализации этой меры в качестве бывшего председателя агентства, согласилась с тем, что ее следует отложить.

«Трудно сказать, но это правильно», — сказала она на общественных слушаниях, которые проводились дистанционно.

Группа по защите климата SanDiego350 также выразила свою поддержку: «Члены SanDiego350 разочарованы тем, что инициатива по транзиту была приостановлена, учитывая ее огромный потенциал для улучшения транспортной системы округа Сан-Диего, сокращения выбросов углерода и повышения качества жизни жителей.Однако мы понимаем, что пандемия коронавируса сделала эту кампанию непрактичной в это время неопределенности ».

У МТС семь рабочих, в том числе пять водителей автобусов, дали положительный результат на коронавирус, поскольку за последние недели количество пассажиров упало примерно на 65 процентов. Чтобы обезопасить рабочих, агентство сократило частоту движения многих автобусных маршрутов и троллейбуса синей ветки.

Должностные лица

Transit ожидают, что агентство получит достаточное федеральное стимулирующее финансирование, чтобы продержаться до июня 2021 года.Эта экстренная помощь пойдет на то, чтобы залатать брешь в размере 135 миллионов долларов в годовом бюджете агентства, составляющую 300 миллионов долларов, в основном из-за резкого падения продаж билетов, а также доходов от существующего местного налога с продаж под названием TransNet.

Перед пандемией МТС праздновала увеличение числа пассажиров, которое, как многие надеялись, изменит многолетнюю тенденцию, влияющую на агентства по всей стране.

В феврале количество пассажиров МТС увеличилось на 9%, что является самым большим увеличением за последние годы, сказал Флетчер на встрече.

«Мы стали свидетелями значительных, а зачастую и беспрецедентных скачков пассажиропотока, когда мы упорно работали над выравниванием маршрутов, так как мы много работали над повышением осведомленности, так как мы много работали над привлечением общественности», — сказал он.

В четверг правление проголосовало за продвижение проектов капитального ремонта на сумму 100 миллионов долларов, включая финансирование электрических автобусов и автобусов, работающих на сжатом природном газе, а также ремонт рельсов.

Для получения дополнительной информации о расписании и сокращении услуг посетите веб-сайт агентства в SDMTS.com.

% PDF-1.4 % 716 0 объект > эндобдж xref 716 84 0000000016 00000 н. 0000003859 00000 н. 0000004058 00000 н. 0000004094 00000 н. 0000004245 00000 н. 0000004565 00000 н. 0000004602 00000 н. 0000004639 00000 н. 0000004692 00000 н. 0000004770 00000 н. 0000005460 00000 н. 0000005962 00000 н. 0000006416 00000 н. 0000006605 00000 н. 0000006857 00000 н. 0000007441 00000 н. 0000007687 00000 н. 0000008518 00000 н. 0000391783 00000 н. 0000413553 00000 н. 0000439901 00000 н. 0000440483 00000 н. 0000496666 00000 н. 0000580636 00000 н. 0000638530 00000 п. 0000694542 00000 п. 0000772540 00000 н. 0000875639 00000 н. 0000876731 00000 н. 0000876973 00000 н. 0000877317 00000 н. 0000877424 00000 н. 0000878193 00000 н. 0000878397 00000 н. 0000878688 00000 н. 0000878743 00000 н. 00008 00000 п. 0000

7 00000 н. 0000

4 00000 н. 00001 00000 п. 0000

8 00000 н. 0000

3 00000 н. 0000

8 00000 н. 00006 00000 н. 00003 00000 н. 0000912430 00000 н. 0000912583 00000 н. 0000912744 00000 н. 0000912869 00000 н. 0000913019 00000 н. 0000913178 00000 н. 0000913315 00000 н. 0000913455 00000 н. 0000913564 00000 н. 0000913691 00000 п. 0000913835 00000 п. 0000914005 00000 н. 0000914139 00000 н. 0000914275 00000 н. 0000914407 00000 н. 0000914567 00000 н. 0000914721 00000 н. 0000914847 00000 н. 0000914987 00000 н. 0000915175 00000 н. 0000915325 00000 н. 0000915487 00000 н. 0000915639 00000 п. 0000915789 00000 н. 0000915935 00000 н. 0000916115 00000 н. 0000916219 00000 п. 0000916317 00000 н. 0000916449 00000 н. 0000916583 00000 н. 0000916731 ​​00000 н. 0000916885 00000 н. 0000917053 00000 н. 0000917203 00000 н. 0000917349 00000 н. 0000917482 00000 н. 0000917633 00000 н. 0000917777 00000 н. 0000001976 00000 н. трейлер ] >> startxref 0 %% EOF 799 0 объект > поток xV} PTU? X кP, ړ V ، 5 +% PY ֲ XMzC% XeL} 0> Zl,> v ߺ f = 9

Обзор жизнеспособности и выживаемости клеток

Каковы индикаторы жизнеспособности клеток?

Жизнеспособность клеток — это мера доли живых здоровых клеток в популяции.Анализы жизнеспособности клеток используются для определения общего состояния клеток, оптимизации условий культивирования или экспериментов, а также для измерения выживаемости клеток после обработки соединениями, например, во время скрининга лекарств.

Обычно анализы жизнеспособности клеток позволяют получить информацию о состоянии клеток путем измерения метаболической активности, содержания АТФ или пролиферации клеток. Жизнеспособность клеток также можно оценить с помощью анализов клеточной токсичности, которые позволяют считывать маркеры гибели клеток, такие как нарушение целостности мембраны.

Вместе анализы жизнеспособности клеток и клеточной токсичности являются важными инструментами для оценки клеточных ответов на интересующие экспериментальные соединения.

Роль пролиферации клеток как индикатора жизнеспособности клеток

Анализы

клеточной пролиферации могут напрямую измерять события деления клеток (подсчет клеток) или использовать маркеры деления клеток / репликации ДНК, такие как содержание ДНК.

Что такое пролиферация клеток

Клеточная пролиферация означает увеличение числа клеток из-за деления клеток (цитокинез), которое происходит на заключительном этапе клеточного цикла.Здоровые клетки активно размножаются, в то время как клетки с задержкой роста, стареющие, мертвые или умирающие клетки — нет. Таким образом, анализы пролиферации клеток являются полезным инструментом для оценки жизнеспособности клеток или выживаемости клеток, обеспечивая считывание количества активно делящихся клеток, присутствующих в образце.

Как измерить пролиферацию клеток

Анализы пролиферации клеток обычно измеряют содержание ДНК или синтез ДНК в реплицирующихся клетках. Анализы пролиферации клеток выполняются с использованием стандартных методов, включая твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), проточную цитометрию, иммунофлуоресценцию и визуализацию высокого содержания.

Анализ клеточного цикла — анализ содержания ДНК

Анализы клеточного цикла используются для определения доли клеток на разных стадиях клеточного цикла с помощью проточной цитометрии. Во время развития клеточного цикла клетки увеличиваются в размерах (фаза G ₁ ), за которой следует синтез и репликация ДНК (фаза S), дальнейший рост (фаза G ₂ ) и, наконец, митоз (фаза M) и клетка. разделение. Клетки, которые выходят из клеточного цикла и перестают делиться, остаются в состоянии покоя (G ₀ ) и называются покоящимися.

Для анализа клеточного цикла клетки фиксируют или пермеабилизируют, инкубируют с интеркалирующим агентом ДНК, таким как йодид пропидия (PI), а затем анализируют с помощью проточной цитометрии. Различия в интенсивности флуоресценции сигнала PI коррелируют с разными фазами клеточного цикла. Например, клетки в фазе G ₂ или M имеют в два раза больше содержания ДНК, чем клетки в фазе G ₀ или G ₁ , что соответствует усиленному сигналу флуоресценции. Клетки в S-фазе обладают различной интенсивностью флуоресценции, которая находится в диапазоне от наблюдаемого для клеток в G ₀ / G ₁ и G ₂ / M фазе.Сигналы флуоресценции ниже пика G ₀ / G ₁ обычно соответствуют апоптозным клеткам с фрагментированной ДНК.

Анализ пролиферации — анализ синтеза ДНК

Во время S-фазы агенты, маркирующие нуклеозиды, такие как 3H-тимидин или 5-бром-2′-дезоксиуридин (BrdU), включаются во вновь синтезированную ДНК. Уровень включения реагента пропорционален количеству делений клеток в целевой популяции. В то время как анализ включения 3H-тимидина требует использования радиоактивности, включение BrdU обнаруживается с помощью антитела против BrdU в ELISA, проточной цитометрии или IF-IC и не требует использования радиоизотопного мечения.

Обнаружение белков пролиферации

Делящиеся клетки обладают высокой экспрессией белков клеточного цикла по сравнению с покоящимися или стареющими клетками, поэтому уровень специфичных для клеточного цикла белков может быть измерен как показание пролиферации клеток. Некоторые распространенные белки пролиферации включают ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), Ki67 и фосфогистон h4, которые могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга (WB), IF, IHC, проточной цитометрии и ELISA.

Старение, указывающее на нарушение пролиферации

Дисфункциональная репликация может привести к старению, и стареющие клетки не будут делиться в ответ на сигналы роста.Таким образом, маркеры старения можно использовать в качестве дополнения к анализам пролиферации клеток. Увеличенный размер клеток, экспрессия pH-зависимой активности β-галактозидазы и измененный паттерн экспрессии генов дополнительно характеризуют стареющие клетки и помогают оценить пролиферацию клеток.

Жизнеспособность клеток

Анализы жизнеспособности клеток используются для определения количества здоровых клеток в образце. Помимо анализов пролиферации, описанных выше, другие анализы жизнеспособности клеток сообщают об общем состоянии здоровья популяции, без различия делящихся клеток от неделящихся клеток.

Как проверить жизнеспособность клеток

Чаще всего жизнеспособность клеток определяется с помощью жизненно важных красителей, таких как йодид пропидия, однако анализы жизнеспособности клеток также обычно измеряют метаболическую активность или содержание АТФ в здоровых клетках.

Метаболические анализы, такие как тесты MTT и XTT, позволяют количественно оценить здоровье клеток путем измерения снижения колориметрического субстрата митохондриальными ферментами. Анализ MTT позволяет количественно оценить относительное количество жизнеспособных клеток с использованием этого подхода.Культуры инкубируют с желтым тетразолиевым красителем МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид), который в здоровых клетках превращается митохондриальными ферментами в нерастворимый пурпурный формазан. После солюбилизации детергентами или изопропанолом количество жизнеспособных клеток можно определить путем измерения оптической плотности при 450 нм в считывающем устройстве для микропланшетов. Анализ жизнеспособности клеток XTT является альтернативой анализу MTT, который дает продукт формазан, растворимый в водных растворах, и, следовательно, не требует дополнительной стадии солюбилизации.

Измерение АТФ анализов позволяют количественно определять содержание АТФ, чтобы определить количество жизнеспособных, метаболически активных клеток в образце. Эти анализы выполняются в многолуночных планшетах с колориметрическим, флуорометрическим или люминесцентным считыванием метаболической активности, требующей АТФ, где образование субстрата пропорционально количеству здоровых клеток с активными митохондриями.

Токсичность клеток

Клеточная токсичность относится к способности вещества повреждать или убивать клетки.Токсичность клеток можно оценить непосредственно с помощью анализов, которые определяют количественно маркеры гибели клеток, такие как потеря целостности мембраны. Токсичность клеток также можно оценить косвенно, используя анализы жизнеспособности клеток, описанные выше.

Анализ клеточной токсичности

является полезным инструментом для оценки выживаемости клеток после лечения фармакологическими агентами или другими стрессорами, а также для изучения влияния соединений на опосредованное иммунными клетками уничтожение опухолевых клеток с использованием анализа уничтожения Т-клеток.

Что такое клеточная токсичность?

Клеточная токсичность относится к способности вещества повреждать или убивать клетки.

Как проверить клеточную токсичность

Доступно множество анализов клеточной токсичности (цитотоксичности), которые сообщают о различных показателях гибели клеток или нарушения здоровья клеток.

Подсчет живых / мертвых клеток используется для измерения количества как живых, так и мертвых клеток в выборке. Например, метод исключения красителя трипановый синий основан на том принципе, что только мертвые или умирающие клетки с поврежденными мембранами поглощают трипановый синий, поэтому количество мертвых (синих) или жизнеспособных (бесцветных) клеток можно подсчитать с помощью гемоцитометра.

The Cell Health Assay — это анализ на основе флуоресценции, используемый для подсчета живых / мертвых клеток, который поддается анализу флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, в котором живые клетки обнаруживаются путем преобразования кальцеина-AM в кальцеин, а мертвые клетки — путем поглощения йодида пропидия. . Платформы визуализации живых клеток также можно использовать для мониторинга гибели клеток в режиме реального времени.

Целостность клеточной мембраны оценивается, чтобы определить, есть ли у клеток повреждение или разрыв мембраны из-за первичного некроза или вторичного некроза после апоптоза.Повреждение мембраны вызывает выброс цитозольного содержимого во внеклеточное пространство, включая фермент лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Количество внеклеточного ЛДГ можно проанализировать с помощью колориметрического анализа, в котором количество образовавшегося продукта коррелирует с количеством мертвых или поврежденных клеток в образце. Целостность клеточной мембраны также можно оценить, анализируя поглощение непроницаемых для мембран красителей, таких как йодид пропидия.

Анализы уничтожения Т-клеток используются для изучения действия тестируемых соединений на опосредованное иммунными клетками уничтожение культивируемых опухолевых клеток.Цитотоксические Т-клетки — это класс Т-клеток, которые распознают и уничтожают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки. В анализе уничтожения Т-клеток опухолевые клетки-мишени сначала метят репортером, который позволяет идентифицировать живые и мертвые клетки. Затем в культуру добавляют тестируемое соединение и цитотоксические Т-клетки, и жизнеспособность опухолевых клеток отслеживают с помощью визуализации живых клеток или проточной цитометрии.

Апоптоз

Апоптоз — это форма запрограммированной гибели клеток, необходимая для правильного роста, развития и гомеостаза многоклеточных организмов, но также может возникать в ответ на клеточный стресс.Это отличается от гибели клеток вследствие некроза, некроптоза и пироптоза. Во время апоптоза клетки претерпевают характерное сжатие, образование пузырей на мембранах, фрагментацию ядер и конденсацию хроматина. Клеточный дебрис упаковывается в апоптотические тельца, которые затем поглощаются и перевариваются фагоцитами.

Апоптоз опосредуется классом протеолитических ферментов, называемых каспазами, которые могут активироваться посредством внутренних (потеря потенциала митохондриальной мембраны и высвобождение цитохрома с) или внешних (связывание лиганда с рецепторами смерти) апоптотических сигнальных механизмов.Более подробная информация о путях и регуляции апоптоза доступна здесь.

Почему происходит апоптоз клеток?

Апоптоз обычно происходит во время роста и развития для уничтожения клеток, которые больше не нужны или потенциально вредны для организма, таких как инфицированные вирусом клетки или клетки, несущие поврежденную ДНК. Нарушение регуляции апоптоза происходит при заболевании, когда повышенные уровни апоптоза связаны с аутоиммунными и нейродегенеративными нарушениями, а пониженные уровни апоптоза возникают при многих раковых заболеваниях.

Апоптоз можно вызвать экспериментально путем инкубации клеток с лигандами, которые связывают рецепторы смерти, включая TNF-R1 и TNF-R2, или с проапоптотическими химическими агентами, такими как стауроспорин или этопозид.

В чем разница между апоптозом, некрозом и некроптозом / пироптозом?

В то время как апоптоз — это форма запрограммированной гибели клеток, некроз относится к незапрограммированной гибели клеток, которая происходит в ответ на острое повреждение или инфекцию. Во время некроза цитоплазма и органеллы набухают, что приводит к потере целостности мембраны и, в конечном итоге, к лизису клеток, что приводит к высвобождению клеточного содержимого во внеклеточное пространство.Некротическая смерть клеток активирует воспалительную реакцию в окружающей области, тогда как апоптотическая гибель клеток — нет. Вторичный некроз обычно возникает в популяциях клеток, подвергающихся обширному апоптозу.

Хотя некроз обычно рассматривается как незапрограммированный механизм гибели клеток, описана регулируемая форма некроза, называемая некроптозом. Некроптоз обеспечивает линию защиты от вирусов, которые блокируют апоптотический аппарат во время инфекции, убивая инфицированные клетки независимым от каспаз образом.Этот путь также активируется провоспалительным сигналом и ишемическим повреждением.

Пироптоз — это форма литической гибели клеток, опосредованная каспазой-1, которая обычно возникает в иммунных клетках в ответ на микробную или вирусную инфекцию.

Как измерить апоптоз

Анализы апоптоза используются для количественной оценки количества клеток, подвергающихся апоптозу. Примеры включают обнаружение связывания аннексина V с открытыми липидами мембраны, активацию каспазы, конденсацию хроматина, фрагментацию ДНК или высвобождение цитохрома c.

Анализ аннексина V

Асимметрия мембраны, или нерегулярное распределение различных видов липидов по обе стороны от плазматической мембраны, нарушается во время апоптоза, поскольку фосфатидилсерин (PS) перемещается от внутреннего к внешнему листку плазматической мембраны. Присутствие PS на наружной створке сигнализирует о поглощении и деградации фагоцитами. Открытый PS может быть распознан конъюгированным с флуорофором аннексином V с использованием проточной цитометрии, IF или ELISA в качестве раннего маркера апоптоза.

Анализ каспазы

Ферменты каспазы превращаются из неактивных зимогенов в активные протеазы во время инициации и выполнения апоптоза. Инициаторы каспазы-8 и -9 активируют каспазы-исполнители, такие как каспаза-3. Расщепление каспазой-3 может быть обнаружено с помощью вестерн-блоттинга, IF, IHC или проточной цитометрии для считывания апоптоза. Активность каспазы-3 и субстраты каспазы, такие как расщепленный PARP, также можно измерить с использованием методов, аналогичных расщепленной каспазе-3, или с помощью ELISA, где степень обработки субстратом пропорциональна количеству апоптотических клеток в образце.Дальнейшее изучение путей апоптоза может быть выполнено с использованием антител к другим активированным каспазам.

Конденсация хроматина

Классическим морфологическим признаком апоптозных клеток является конденсация ядерного хроматина из гетерогенного в компактное состояние. Конденсацию хроматина можно наблюдать с помощью окрашивания ядер и IF или проточной цитометрии. При окрашивании ядерными красителями апоптотические клетки имеют более сильный флуоресцентный сигнал из-за присутствия конденсированного хроматина.

TUNEL анализ

разрывов цепей ДНК и фрагментация ДНК характерны для поздней стадии апоптоза и могут быть обнаружены с помощью мечения ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) dUTP (анализ TUNEL) для количественного определения количества апоптотических клеток в популяции с помощью IF, IHC, планшет-ридера. , или проточная цитометрия. Фермент TdT катализирует добавление меченых dUTP, таких как dUTP, конъюгированных с флуорофором или биотином, в участки двухцепочечных разрывов ДНК.Апоптотические клетки или другие клетки с повреждением ДНК помечаются модифицированным dUTP, а здоровые клетки — нет. Фрагментированную ДНК из апоптотических клеток также можно наблюдать с помощью стандартного гель-электрофореза, поскольку фрагментированная ДНК будет выглядеть ступенчатой ​​по сравнению с интактной ДНК из здоровых клеток.

Анализ высвобождения цитохрома c

Апоптотические стимулы запускают транслокацию цитохрома с из митохондрий в цитозоль. Клеточное фракционирование можно использовать для отделения митохондрий от цитозоля с последующим иммуноблоттингом с антителом против цитохрома c.

Как измерить некроз и некроптоз / пироптоз

Некротическая гибель клеток в первую очередь характеризуется потерей целостности клеточной мембраны, что приводит к высвобождению клеточного содержимого во внеклеточное пространство, что может быть обнаружено с помощью внутриклеточных и секретируемых маркеров, таких как HMGB1, LDH и IL-1β.

Некроптоз, генетически запрограммированная форма некроза, характеризуется образованием некросомы, белкового комплекса, содержащего киназы RIP и RIP3.Некроптоз можно оценить путем измерения экспрессии или посттрансляционной модификации этих и связанных с ними белков, связанных с некроптозом (например, MLK1).

В ответ на микробные инфекции формируются инфламмасомы, инициирующие каспазу 1-зависимый пироптоз. Расщепление, опосредованное каспазой 1, приводит к активации провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18. Каспаза-1 также расщепляет газдермин D, что приводит к олигомеризации N-концевого фрагмента, образуя поры мембраны, позволяющие секрецию IL-1β, IL-18 и других DAMP.

Оптимальный анализ для измерения выживаемости клеток зависит от многих факторов, включая экспериментальный контекст и исследуемую популяцию клеток. Для подтверждения результатов эксперимента может потребоваться несколько независимых анализов.

Рекомендации по выбору наилучшего метода оценки выживаемости клеток

Тип клеток — Эксперименты, проводимые с делящимися клетками, поддаются анализу выживаемости с помощью анализов, которые оценивают пролиферацию клеток, метаболическую активность или нарушение целостности мембран.Для постмитотических или неделящихся клеток, таких как нейроны, наилучшим выбором являются анализы метаболической или мембранной целостности. Плотность посева и условия культивирования должны быть стандартизованы для оптимального выполнения анализа и обеспечения воспроизводимости результатов.

Время — При выборе анализа жизнеспособности или токсичности клеток следует учитывать экспериментальный временной ход, поскольку продолжительность лечения может влиять на выживаемость клеток. Кроме того, некоторые маркеры клеточной гибели могут присутствовать только на определенных стадиях процесса апоптоза, таких как транслокация PS, которая происходит на ранней стадии апоптоза, или фрагментация ДНК, которая происходит на поздних стадиях апоптоза.

Механизм гибели клеток — Хотя стандартные анализы жизнеспособности клеток и клеточной токсичности предоставляют количественные данные о живых или мертвых клетках в образце, они не дают представления о механизме гибели клеток в экспериментальном контексте. Целевые эксперименты с использованием анализов, специфичных для путей гибели клеток (например, апоптоза), необходимы для выяснения точного механизма (ов) гибели клеток.

Интерпретация анализа — Экспериментальные соединения могут не вызывать гибель клеток, а, скорее, изменять клеточный метаболизм или пролиферацию клеток, что может неправильно интерпретироваться как снижение жизнеспособности.Важно использовать комбинацию анализов жизнеспособности клеток и клеточной токсичности, чтобы различать эти возможности.

Измерение жизнеспособности ячейки методом проточной цитометрии

В то время как многие анализы жизнеспособности клеток сообщают о здоровье клеток косвенно через измерение пролиферации или метаболической активности, проточная цитометрия облегчает прямую идентификацию живых и мертвых клеток в образце. Как правило, непроницаемый для мембран краситель, такой как йодид пропидия, используется для идентификации мертвых или умирающих клеток с поврежденными мембранами, а краситель жизнеспособности, такой как кальцеин-AM, используется для мечения живых клеток.

Иммуногистохимия (ИГХ) для анализа жизнеспособности клеток

Иммуногистохимия (ИГХ) использует антитела для обнаружения популяций клеток в образцах тканей, которые экспрессируют специфические антигены. Этот подход обычно используется для определения временного распределения белков во время развития, анализа паттернов экспрессии белков при заболевании по сравнению со здоровой тканью и для различения индивидуальных типов клеток на основе экспрессии биомаркеров. ИГХ можно также использовать для измерения выживаемости клеток в контексте анализа образцов ткани.Например, жизнеспособность клеток можно оценить путем количественного определения количества клеток, экспрессирующих пролиферативные маркеры, такие как Ki67 или PCNA, что особенно важно при определении эффекта лечения на пролиферацию опухолевых клеток. Помимо анализа TUNEL, апоптотические клетки можно идентифицировать путем окрашивания ткани на антитела против расщепленной каспазы-3 и расщепленного PARP.

.